瘤背石磺（Onchidium reevesii）是一种生活在潮间带具有两栖性的软体动物,广泛的分布于我国的沿海城市,其神经系统简单、容易分离,方便研究者进行神经系统的相关研究,是一种良好的神经生物学模式生物。在上世纪就有学者发现瘤背石磺在潮水上涨到一定高度时,它们便会攀爬到潮间带的芦苇杆上或是天然洞穴中躲避潮水,以免自己被潮水淹死,这种独特的行为被研究者称为“归家行为”,然而关于这种行为的形成,还没有很好的相关报导,最近一些研究者认为瘤背石磺依靠“听”潮汐产生的低频声音,来及时的躲避潮水。Pedal peptide（Pep）是一种调控软体动物平衡囊功能的神经肽,可以充当神经递质控制软体动物的运动,因此我们推测Pep可能在瘤背石磺“归家行为”的形成中发挥作用。于是本文以瘤背石磺神经节为主要实验材料,使用RACE技术克隆了Pedal peptide基因的全长c DNA并使用实时荧光定量PCR技术分析Pedal peptide基因的表达模式,初步探究了瘤背石磺的低频听力与潮汐感知能力,为后续研究潮间带生物的潮汐节律及软体动物的听力提供理论依据。1.Pedal peptide基因的克隆、组织表达及RNA干扰分析我们通过RACE技术成功克隆了瘤背石磺的Pedal peptide基因（Orpep）c DNA全长共1627 bp,该c DNA包括308 bp的5′非编码区、1041 bp开放阅读框和278 bp的3′非编码区。生物信息学分析显示Orpep基因编码产生一段346氨基酸数目的包含15个拷贝Pep（PFDSISGSHGLSGFA）的Pedal peptide前体蛋白,并且该前体蛋白分子量为36,676 ku,等电点为7.32 p I。对不同组织的荧光定量PCR（q PCR）结果显示,Orpep基因只在神经节中表达,神经节是该基因的主要合成与调控部位。对Orpep基因的RNA干扰分析显示,磷脂酶C（PLC）、钙调素（Ca MKⅡ）、丝裂原激活蛋白激酶（Mapk1）基因是Orpep基因的靶基因,并且Orpep基因调控Ca MKII基因的表达,PLC和Mapk1基因调控Orpep基因的表达。并且相关实验显示低频声音和潮汐影响会影响瘤背石磺PLC、Ca MKⅡ、Mapk1基因的表达,综上所述,我们推测Orpep基因会在瘤背石磺低频听力和潮汐感知的形成中发挥作用。2.潮汐感知与低频听力之间的关系验证通过检测Orpep基因在低频声音及潮汐刺激下的表达变化和分析潮汐产生的低频声音,我们研究了瘤背石磺低频听力与潮汐感知的关系。潮汐刺激的q PCR结果显示,当潮水处于一定高度时,Orpep基因处于高表达的状态,并且其表达量与潮汐的高度变化是一致的。低频声音刺激实验则显示了Orpep基因在100 Hz-130Hz的低频声音刺激下表达量显著提升（p＜0.05）,这个频率段的声音与潮汐产生的低频声音是一致的。综上所述,我们推测瘤背石磺依靠感知潮汐产生的低频声音,来分辨潮水的状态从而在涨潮的时候及时的躲避潮水或者是在退潮后及时的出来觅食。3.瘤背石磺神经节中Orpep基因的荧光原位杂交分析通过利用荧光原位杂交（FISH）技术,我们分析了Orpep基因在瘤背石磺神经节的分布及潮汐刺激和低频声音刺激后的分布变化。FISH结果显示足神经节是Orpep基因的主要分布区域,而在潮汐刺激或低频声音刺激后,Orpep基因的分布从足神经节扩散到了脑神经节、脏神经节和侧神经节中,这表明瘤背石磺的低频听力与潮汐感知依赖于多个神经节的相互作用。此外我们还计算了FISH结果中的平均荧光强度,结果显示低频声音刺激组和潮汐刺激组的Orpep基因的杂交信号强度要大于未受到刺激的实验组,这个结果与之前的q PCR的结果是一致的。4.卡那霉素对瘤背石磺的影响氨基糖苷类药物是一类具有耳毒性的抗生素,其会引起软体动物平衡囊内的感觉毛细胞的纤毛发生损伤,导致软体动物听力损失。瘤背石磺的听力关乎着其能否正常的躲避潮水以免被淹死,因此为了研究氨基糖苷类药物对瘤背石磺低频听力的影响,我们检测在卡那霉素处理后瘤背石磺神经节中的SDH酶、Na+-Ka+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性变化和不同频率声音刺激下Orpep基因的表达变化。酶活性测定的结果显示在卡那霉素处理后瘤背石磺神经节中SDH酶、Na+-Ka+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著下降（p＜0.05）,q PCR结果显示在60 Hz,110 Hz和130 Hz声音刺激下瘤背石磺神经节中Orpep基因的表达有显著升高（p＜0.05）,并且卡那霉素处理使得Orpep基因的表达再次显著提升（p＜0.05）。我们推测卡那霉素对瘤背石磺具有耳毒性,导致瘤背石磺听力损失,而在受到卡那霉素刺激后,瘤背石磺可以通过提高Orpep基因的表达抵御卡那霉素的耳毒性作用。