嗜热厌氧梭菌乙醇耐受性改造及发酵低品位生物质产乙醇的特性研究

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嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)最适生长温度为55-60°C,最适pH为7左右。它能产生一种包含纤维素酶、木聚糖酶等组分的酶复合体——纤维小体(cellulosome),可以直接分解纤维素用于细胞生长并产生乙醇、乙酸、乳酸、氢气和二氧化碳等代谢产物。燃料乙醇的发展已经来到以木质纤维素为原料的时代,C.thermocellum能直接分解纤维素并生成乙醇和氢气两种新能源使其成为潜在的集成生物工艺(Consolidated Bio-processing, CBP)的菌株。C.thermocellum摇瓶培养只能利用约5g/L的纤维素或者纤维二糖,因为培养基pH随其生长产酸下降而抑制生长。此外C.thermocellum野生菌只能耐受1-2%的酒精,这大大限制了其工业应用。本研究采用外源酒精胁迫的方法通过61代的连续传代成功将C.thermocellum野生菌的酒精耐受性提高到5.0%。驯化菌在5g/L纤维素底物的摇瓶培养后,乙醇产量为1.23g/L,较野生菌提高了20.58%;以20g/L纤维素为底物进行反应器培养,驯化菌的乙醇产量在96h达到最高值为5.17g/L,相较野生菌提高了28.93%,说明驯化过程对于C.thermocellum的乙醇产量有明显的提高。木薯渣易发酸发臭污染环境,但其淀粉和纤维素含量丰富,是理想的低品位生物质原料。产纤维小体的C.thermocellum驯化菌和产淀粉酶与木聚糖酶的Thermoanaerobacterium aotearoenseΔldh二者共培养时表现出良好的协同作用,在55°C、150rpm共培养发酵木薯渣相较二者的单独培养能积累更多的可发酵糖,之后再降温到37°C接种酿酒酵母可在24h内利用完残糖并生成乙醇。C.thermocellum与T. aotearoense共培养,二者接种比例1:1,嗜热培养84h,底物浓度4%,厌氧方式接种6%的酵母为此两阶段共培养发酵的最佳条件,最终乙醇浓度为8.93g/L,发酵效率为64.95%,乙醇产率为0.081g/(L·h),氢气产量为4.06mM。此两阶段共培养的发酵方式不用外加酶且乙醇产量达到单独酶解发酵的水平,是一种新的CBP途径。C.thermocellum能直接发酵未经任何预处理的造纸污泥,在化学制浆污泥中其乙醇产量最高达到7.41g/L,纤维素酶活和木聚糖酶活最高分别达到1.92FPU/mL和1.30U/mL;在脱墨污泥里其发酵受到明显的抑制,乙醇产量只有1.31g/L,纤维素酶活和木聚糖酶活分别为1.64FPU/mL和0.90U/mL。C.thermocellum粗酶液纤维素酶最适温度为60°C,最适pH为5.5;木聚糖酶最适温度为70°C,最适pH为7.0,两种酶都表现出较广的金属离子适应性。
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