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乳管是橡胶树合成和贮存天然橡胶的组织,乳管的数量是影响橡胶产量的关键因素。研究表明,机械损伤或外施茉莉酸能诱导橡胶树次生乳管分化,开割树比未开割树乳管列数更多,说明茉莉酸是调节乳管分化的关键信号分子,但茉莉酸信号影响橡胶乳管的分化及调控胶乳生物合成的分子机理至今未明,成为橡胶基础研究及橡胶生产技术提升的理论瓶颈。研究表明,橡胶萌条刮伤诱导次生乳管可以通过在刮伤位点包裹薄膜而受到抑制,为了克隆橡胶乳管分化相关基因,实验室前期采用SSH差减杂交方法筛选刮伤后暴露和刮伤后包裹两种处理的差异表达基因,然后通过反向Northern进行验证,发现差减文库中包含多个可能与植物脱水相关的基因,其中有两个脱水素基因(HbDHN1和HbDHN2)和一个NAC 转录因子(HbNAC1)。我们推测HbDHN1、HbDHN2 和HbNAC1很可能与橡胶受伤后局部组织脱水胁迫相关,而受伤后局部组织脱水可能是诱导橡胶乳管分化的一个重要信号,为了验证这个假设,本文开展了以下研究:(1)为了进一步验证差减杂交筛选结果,我们利用qRT-PCR分析HbDHN1,HbDHN2和HbNAC1基因在刮伤后暴露和刮伤后包裹两种处理的表达,结果显示与差减杂交结果一致,样品处理1h时,包裹处理的三个目的基因表达量高于创伤暴露于空气中的处理样品的表达量,但是,HbNAC1和HbDHN2的应答更持久,在处理6 h时出现表达最高峰,而包裹处理样品的表达最高峰值出现在1 h。(2)为了验证脱水信号是否是影响橡胶树乳管分化的关键信号,采用石蜡切片技术,研究脱水对次生乳管分化的诱导效应。结果表明受伤后涂抹10%PEG6000,然后立刻包裹薄膜,即脱水处理可诱导橡胶树萌条次生乳管分化。(3)为了分析HbDHN1和HbDHN2的蛋白结构,我们将巴西橡胶树中克隆到两个脱水素基因与不同来源的其他脱水素基因进行蛋白多序列比对和进化树分析,结果表明,橡胶树脱水素蛋白HbDHN1和HbDHN2都属于SK2型脱水素。(4)组织差异表达分析:巴西橡胶树HbNAC1,HbDHN1和HbDHN2基因在橡胶树不同组织中均表达,且HbNAC1在胶乳中表达量最低,HbDHN1和HbDHN2基因在茎尖中表达量最高。运用PlantCARE软件分析其启动子的顺式作用元件,结果显示:HbNAC1,HbDHN1 和HbDHN2启动子均含有 ABREs,CGTCA-motifs,TGACG-motifs,LTRmotif等胁迫应答相关顺式作用元件。qRT-PCR分析发现,不同非生物胁迫处理都能诱导HbNAC1,HbDHN1和HbDHN2基因的表达,说明HbNAC1,HbDHN1和HbDHN2可能参与多个非生物胁迫的应答调控。(5)为了研究HbNAC1是否是一个转录因子,我们首先对橡胶树HbNAC1蛋白进行亚细胞定位,结果表明橡胶树HbNAC1定位于细胞核。此外,为了检测HbNAC1是否具有转录激活活性及活性位点,我们将HbNAC1不同长度的片段构建pGBKT7载体,转化酵母Y2H Gold菌株。发现HbNAC1转录因子具有转录激活活性,其转录激活结构域位于C-端。该结果表明,HbNAC1具有转录因子特征。(6)为了研究HbNAC1是否参与橡胶树胶乳合成相关基因的表达调控,我们利用酵母单杂及EMSA技术,验证HbNAC1能与顺式作用元件CACG/CATGTG结合。采用酵母单杂技术筛选HbNAC1与5个橡胶胶乳合成相关基因启动子的互作,结果显示HbNAC1与HbSRPP启动子互作。为研究HbNAC1如何调控HbSRPP基因的转录,我们将pHbSRPP::GUS和35S::HbNAC1共转化烟草,结果发现在烟草中过表达HbNAC1上调HbSRPP启动子介导GUS基因的表达,说明HbNAC1在植物体中可能与HbSRPP启动子结合并提高该基因的表达。(7)通过植物转化试验发现,过表达HbNAC1转基因烟草的存活率、相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量和APX活性等方面都明显高于野生型,而电导率、超氧离子O2-和H202含量明显低于野生型,说明转基因植株提高了对干旱胁迫的耐受性。此外,转基因烟草中胁迫应答相关基因ERD10C,LEA5,PP2C2,NECD3的表达量也明显高于野生型,说明HbNAC1是通过调控下游胁迫相关基因的表达来提高对干旱胁迫的耐受性。(8)为了进一步鉴定HbDHN1和HbDHN2基因的功能,我们构建HbDHN1和HbDHN2过表达载体并转化拟南芥。获得T3转化纯合体后进行非生物胁迫分析,结果表明过表达HbDHN1和HbDHN2提高了转基因拟南芥对渗透胁迫、干旱和盐胁迫的抗性,并且发现脱水素基因可能通过影响植物体内氧化还原平衡来直接或间接地影响橡胶树乳管分化。综上所述,我们得出结论:橡胶HbDHN1、HbDH和HbNAC1基因都参与脱水和干旱胁迫。橡胶萌条刮伤后,伤口暴露在空气中可能导致局部组织脱水,从而诱导脱水相关基因HbDHN1、HbDHN2和HbNAC1基因的表达,而受伤后的局部组织脱水是诱导橡胶乳管分化的一个重要信号。橡胶基因HbDHN1、HbDHN2和转录因子HbNAC1参与多个非生物胁迫反应,并且发现脱水素基因可能通过影响氧化还原平衡直接或间接地影响乳管分化。此外,HbNAC1能结合胶乳合成相关基因HbSRPP的启动子并调控该基因的表达,因此是一个橡胶产排胶调控相关基因。