免疫响应是研究肿瘤发展,提高治疗疗效的关键因素。免疫响应是免疫细胞与肿瘤细胞及免疫细胞间相互作用而引起的反应,如分泌多种功能蛋白。巨噬细胞是肿瘤微环境中占主要成分的天然免疫细胞,巨噬细胞的数量比例及功能表型在肿瘤发展的不同阶段都具有重要作用。但由于肿瘤细胞和巨噬细胞都具有高度异质性,其深入研究需借助于单细胞分析技术。目前,单细胞蛋白分析技术主要包括基于胞内染色(如荧光流式细胞仪,质谱流式细胞仪)和基于微流控发展的微雕术和单细胞条形码技术。分泌蛋白分析是检测分泌到胞外的蛋白,真实反映细胞影响微环境后的免疫响应,且胞外分泌的动态检测能够追踪连续的免疫变化。但目前,这些技术都是基于2D培养模式,而肿瘤是一个复杂的三维(3D)微环境,除肿瘤细胞外,还存在多种免疫细胞及基质等,因此,如何构建3D肿瘤微环境且单细胞水平上研究高度异质性的肿瘤免疫细胞是尚未解决的问题。肿瘤复杂的3D微环境,通过复杂的化学信号与周围组织建立动态的交互作用。目前,基于微流控芯片发展的肿瘤3D培养,具有样本耗费少、通量高、集成化水平高等优点,在肿瘤3D微球形成,培养及肿瘤研究中应用广泛。但发展简单,易控制的高通量肿瘤微球培养方法仍是研究重点。基于以上背景,我们开展了以下工作:一,基于微流控技术发展了一种简单,高通量的3D肿瘤微球成球方法,并在此芯片中进行了长时间的培养。以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料,我们制作了 10800微孔阵列芯片,以含表面活性剂F68的培养液培养肿瘤细胞,即可促进肿瘤成球。我们考察了 F68浓度对人乳腺癌细胞(MCF-7),人口腔鳞癌细胞系(SCC25),口腔鳞癌原代细胞(OSCC)增殖及其群体细胞蛋白分泌影响,发现F68浓度为0.04%时,F68加入对细胞增殖与蛋白分泌无明显影响。在此基础上,我们分析了 0.04%F68培养条件下,肿瘤细胞数目与肿瘤微球面积及长时间培养(12天,细胞活性良好)的微球生长关系。结果表明,我们成功发展了一种简单,易操作的高通量3D肿瘤微球方法,并用于3D肿瘤微球的长时间培养且细胞保持良好活性。二,在SCC25肿瘤微球条件下,考察人组织细胞淋巴瘤细胞(U937)分化的巨噬细胞动态的免疫响应。在SCC25肿瘤微球和巨噬细胞共培养12h的条件下,我们发现SCC25肿瘤微球的存在抑制了单个U937分化的巨噬细胞TNF-a和IL-6分泌,而IL-8分泌变化不大。多个巨噬细胞的三种分泌蛋白与单个巨噬细胞的趋势一致。在两次连续检测中,发现在LPS刺激下,SCC25微球进一步抑制了 TNF-a和IL-6的分泌率。以上结果表明3D肿瘤微环境抑制了巨噬细胞的免疫响应。