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巨胚水稻是一种种子胚组织变大的突变体。因其含有丰富的γ-氨基丁酸(GABA)、维生素E、不饱和脂肪酸和矿物质等营养成份,现今备受世界关注,并有着极高的市场应用价值和开发前景。同时巨胚突变表型的产生也为从分子机理上探索水稻胚胎发育提供了一个良好研究材料。已有研究发现,生长素对于植物胚胎和器官的发育具有重要作用。本课题组前期检测了“上师大5号”巨胚突变体和正常胚对照“超2-10”水稻不同发育时期种子内源生长素(IAA)含量,结果发现,“上师大5号”种子IAA含量在开花6天后至开花18天前均高于对照“超2-10”,其中在开花后第10天(10 DAF)两者的IAA含量差异最大,之后差异逐渐变小,直到开花后第18天(18 DAF)“上师大5号”IAA的含量回落到与对照相同的水平。目前国内外对巨胚水稻的细胞形态学观察、营养成分鉴定和巨胚基因克隆等方面都已有研究报道,但是关于巨胚水稻种子发育期间IAA含量变化原因研究目前还鲜有报道。本研究以巨胚突变体“上师大5号”水稻及其正常胚对照“超2-10”水稻为材料,对巨胚水稻种子发育早期和中期内源生长素含量改变原因进行分析以及对生长素早期响应基因在巨胚性状形成中的作用进行初步探究。主要研究结果如下:通过对生长素合成相关基因的组织表达谱Heatmap聚类分析和q RT-PCR检测发现,Os YUCCA9、Os YUCCA11和Os TAR1在两种供试水稻种子中的表达量都较高。该研究结果进一步证实了这三个基因是水稻种子发育中IAA合成的重要基因。比较两种供试水稻显示,Os YUCCA11和Os TAR1表达水平在6 DAF至10 DAF的“上师大5号”种子中都明显上调,而且在10 DAF时期,这两个基因的表达量都显著高于正常胚“超2-10”对照水稻。进一步将两种供试水稻种子进行胚和胚乳分离,q RT-PCR分析发现,Os YUCCA1基因尽管在整粒种子中相对表达量较低,但该基因在胚中表达量高于胚乳,而且在“上师大5号”中表达水平明显上调;Os YUCCA9、Os YUCCA11和Os TAR1则主要表达于胚乳中,并且表达趋势与整粒种子相一致。根据对生长素合成相关基因表达分析的结果推测,在6 DAF至10DAF的“上师大5号”种子中,IAA含量提高可能是由于Os YUCCA1、Os YUCCA11和Os TAR1表达水平上调引起的。为了探索“上师大5号”种子IAA含量在10 DAF至18 DAF逐渐回落到与正常胚水稻相同水平的原因,本研究又采用q RT-PCR分析了生长素早期响应基因中的GH3基因家族成员表达水平。结果发现,GH3-2、GH3-4和GH3-8在“上师大5号”种子中表达量明显上调,说明生长素早期响应基因中的GH3基因家族部分成员对10 DAF“上师大5号”种子高IAA含量已作出响应。其中GH3-8基因编码一个氨基合成酶能够结合游离的IAA,可降低内源IAA含量。在“上师大5号”10 DAF至18 DAF种子中,GH3-8基因的表达趋势与IAA含量变化趋势高度一致,并且在10 DAF的时候表达量明显上调,而且明显超过其他GH3基因的表达量。此结果表明,对于“上师大5号”种子10 DAF至18 DAF IAA含量回落可能是由于GH3基因家族成员在平衡巨胚水稻种子内源生长素机制中发挥了作用,其中GH3-8可能是一个相对更为重要的基因成员。生长素早期响应基因中的Aux/IAA基因家族和生长素响应因子(ARF)基因家族是生长素信号传导途径中的重要参与者。为了探究10 DAF“上师大5号”种子IAA含量显著性提高后是否也引起了生长素信号传导途径的响应。本研究针对水稻的31个Aux/IAA基因家族成员和25个ARF基因家族成员分别构建了表达谱Heatmap聚类分析图,从中筛选出在种子中高表达的12个Aux/IAA基因和8个ARF基因,进一步利用q RT-PCR进行表达分析。结果发现,IAA4、IAA9、IAA26、ARF11、ARF15和ARF17在“上师大5号”中的表达量明显上调,而IAA14、IAA29和ARF14在“上师大5号”中的表达量明显下调。这说明,“上师大5号”种子在10 DAF高含量的IAA可能已引起了生长素信号传导途径的参与。有趣的是两种供试水稻的IAA29基因在所有筛选出的Aux/IAA基因中相对表达量最高,并且在“上师大5号”种子中的表达量下调幅度也非常大。由此推测,IAA29对水稻巨胚性状的形成可能具有重要作用。本研究再进一步利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对Os IAA29和Os GH3-8进行转基因功能验证,另一方面对这两个基因进行相关生物信息学分析。通过表达谱网站分析显示Os IAA29和Os GH3-8都是种子中高表达的基因,Os IAA29特异表达于胚乳;亚细胞定位网站预测结果表明,Os IAA29是核定位基因,而Os GH3-8定位于细胞质;对31个水稻的Aux/IAA蛋白家族序列比对结果发现,Os IAA29蛋白没有结构域I,有完整的结构域III和IV,而结构域II似乎并没有完全缺失。对拟南芥、玉米、高粱和水稻的Aux/IAA蛋白家族进行系统进化树分析显示,Os IAA29与Os IAA28亲缘关系最近,其次与玉米Zm IAA29亲缘关系较近,而在拟南芥中没有直系同源基因;单独对水稻13个GH3蛋白的系统进化树分析显示,GH3-8蛋白属于II类,与已报道结果相一致。目前已获得2棵Os IAA29基因的CRISPR阳性转基因再生苗。本研究获得的结果,为今后进一步开展生长素相关基因与水稻巨胚表型之间关系的研究奠定了重要基础。