癌基因和肿瘤抑制基因一直是肿瘤发病的研究热点。目前认为造血系统恶性疾病是由于细胞的异常增殖和成熟障碍所引起,且是一个多步骤的过程,第一步往往是由于控制细胞生长的基因异常表达或其编码蛋白功能异常。调控细胞转化最常见的一类基因是以转录因子形式起作用的那些基因,它们最终导致细胞转录调控异常。当前白血病发病机理研究一方面集中于具有特异染色体移位和特异基因重排的病种,如t(8;21)和AML1/ETO, t(15;17)和PML/RAR a等;另一方面在于调节细胞生长增殖、凋亡及信号传导的非特异基因。由于具有特异融合基因表达的急性白血病越来越多,因此白血病发生发展有关的非特异基因研究仍是目前研究的焦点。Gfi-1的癌基因潜能是作为一个大鼠T细胞淋巴瘤的MOMULV的整合位点而发现的。已在神经胶质瘤,乳腺癌,子宫内膜癌等大量肿瘤中发现了该基因的异常。目前的研究发现Gfi-1参与了细胞的生长,细胞周期调节,信号传导通路的调控,在肿瘤的发生和转移中起到非常重要的作用。所有这些研究提示Gfi-1可能是一个癌基因,并在肿瘤的发病机制中有关键性的作用。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一个有着不同种类的染色体异常和基因突变的克隆性疾病,我们研究了急性髓系白血病中Gfi-1表达和临床的相关性。我们用RT-PCR方法检测了处于不同病程中的AML患者Gfi-1的表达情况,分析了其与初治AML细胞免疫表型与急性髓系白血病的某些生物学特性及其病程有关。并检测了Gfi-1蛋白在AML中的表达,用confocal观察了Gfi-1蛋白在AML细胞中的亚定位。并在造血组细胞中观察了Gfi-1基因和蛋白的表达。并用阿霉素处理HL-60细胞,观察对细胞增殖分化、凋亡过程中Gfi-1及凋亡蛋白Bax和Bcl-2的关系。对明确化疗药物治疗白血病的可能机制进行了进一步的研究,并为癌基因Gfi-1作为肿瘤治疗的新靶点提供实验依据。第一部分癌基因Gfi-1在急性髓系白血病中的表达及意义目的了解急性髓系白血病细胞中Gfi-1基因的表达情况及其与临床的关系。方法1. 5株白血病/淋巴瘤细胞系(HL-60, Jurkat, K562,U937, Molt-4 ), AML患者92例(M1 17例、M2 30例、M3 16例、M4 4例、M5 21例、M6 4例)。初诊AML73例,完全缓解(AML-CR)19例。采用RT-PCR和Western-blot方法,分别检测了以上5株白血病/淋巴瘤细胞系和AML骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclearcell,BMMNC)中Gfi-1的表达。并以10例非肿瘤性血液病患者(包括缺铁性贫血、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜等)和5例健康供者骨髓作为正常对照。2.我们对92例急性髓系白血病中Gfi-1基因阳性表达率与患者的一些临床指标(患者的年龄,性别,肝脾有无肿大,外周血白细胞记数)进行相关性分析,我们根据外周血白细胞计数将白血病患者分为2组:①肿瘤低负荷组:外周血WBC<20×109 /L;②肿瘤高负荷组:具备外周血WBC≥20×109 /L。3.用激光共聚焦显微镜观察Gfi-1蛋白在骨髓MNC的表达和分布。结果1.通过RT-PCR发现在所检测的5株白血病/淋巴瘤细胞系(HL-60, Jurkat, K562,U937和Molt-4)中,细胞系Gfi-1mRNA均呈阳性表达,但程度不一。HL-60, K562和Jurkat细胞Gfi-1基因呈明显的强阳性表达(R≥1.0()R =Gfi-1 DNA条带与β-actin DNA条带吸光度的比值),在U937, Molt-4中呈现中等强度的表达(0.6<R<1.0),对92例急性髓系白血病病患者和15例对照人骨髓中Gfi-1基因mRNA的表达检测结果显示,Gfi-1 mRNA在初治急性髓系白血病中的表达(1.44±0.13)比对照骨髓(0.24±0.02)明显增高(p<0.01)。对初治病例73例AML患者按照FAB分型后,Gfi-1在M1 17例(1.25±0.14 )、M2 30例(1.08±0.08 )、M3 16例(1.43±0.18 )、M4 4例(1.31±0.11 )、M5 21例(1.29±0.10 )、M6 4例(1.23±0.13 )例中的表达明显较对照组增高,但是在各型中的表达无差异。初治病例表达明显较完全缓解病例(AML-CR)19例(0.34±0.01 )高,而AML-CR比对照组(0.24±0.02 )增高,但表达无统计学差异。2.我们对92例急性髓系白血病中Gfi-1基因阳性表达率与患者的一些临床指标(患者的年龄,性别,肝脾有无肿大,外周血白细胞记数)进行相关性分析,发现Gfi-1的表达与患者的年龄,性别及肝脾肿大等无明显相关性(P>0.05),而与外周血白细胞计数有关。其中,外周血白细胞计数≥20×109 /L的白血病患者骨髓单个核细胞Gfi-1mRNA阳性表达率为100%( 44例);外周血白细胞计数<20×109 /L为75.86% (22例),两者相比有统计学意义(p<0.05)。正常对照者和外周血白细胞计数<20×109 /L患者的表达差异有统计学意义(p<0.01)。3. Gfi-1蛋白在急性髓系白血病的表达我们对急性髓系白血病中Gfi-1蛋白表达情况进行了Western-blot分析,对AML患者和对照人骨髓中Gfi-1蛋白的表达检测结果显示,Gfi-1蛋白在初治AML中的表达(2.15±0.23)比对照骨髓(0.46±0.02)明显增高(p<0.01);初治病例表达明显较完全缓解病例(AML-CR)19例(0.78±0.01 )高,而AML-CR比对照组(0.46±0.02 )增高,但表达无统计学差异(P>0.05)。4. Confocal观察Gfi-1在细胞中的的定位首先研究细胞系中Gfi-1定位情况。通过Confocal发现在所检测的5株细胞系细胞核中都有Gfi-1表达,但程度不一。在HL-60,K562和Jurkat细胞中,能够检测到细胞核和胞浆都有Gfi-1的强阳性表达;在U937, Molt-4细胞中,细胞核和胞浆有中等强度的Gfi-1表达。对于13例AML和5例正常供者的骨髓单个核细胞Confocal分析表明,Gfi-1主要位于细胞核中,尤其位于急性髓系白血病患者原始细胞细胞核中,大多数AML患者细胞核中Gfi-1出现较强的表达以及少量的细胞浆内表达。在正常骨髓和其他血液病骨髓单个核细胞中细胞核内没有或者仅少量可以检测到Gfi-1的表达。结论急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表达,该表达在肿瘤负荷高的急性髓系白血病患者显著增高。分析Gfi-1表达与临床指标相关性发现这种高表达与外周血高白细胞计数呈显著的正相关性,而与患者的年龄,性别及肝脾肿大等无明显相关性。提示Gfi-1可能是急性髓系白血病细胞生长的癌基因。而且在急性髓系白血病的发病中,Gfi-1基因可能是作为一个独立的影响因索来发挥作用的。第二部分癌基因Gfi-1在正常和急性髓系白血病造血祖细胞中的表达目的了解急性髓系白血病细胞中Gfi-1基因在造血组细胞中的表达情况。方法采用流式细胞分选AML16例初诊(M1 7例、M2 6例、M3 3例),完全缓解(AML-CR)3例和3例健康供者骨髓(正常对照)的CD34+细胞。采用RT-PCR和Western-blot方法分别检测了CD34+细胞中Gfi-1的mRNA和蛋白表达。结果1.对16例急性髓系白血病患者和3例对照人骨髓CD34+细胞中Gfi-1基因的RT-PCR表达检测结果显示,在AML组和AML-CR组Gfi-1阳性(分别为1.42±0.13和0.58±0.04)均高于正常水平(0.14±0.02) (P<0. 0 1和P<0. 05) , AML组和AML-CR组相比,AML组Gfi-1表达又高于AML-CR组(P<0. 05)。AML中各亚型:M1 7例(1.14±0.11 )、M2 6例(1.32±0.14 )、M3 3例(1.47±0.15)之间Gfi-1表达情况的相比较,无统计学差异(P>0. 05)。2.对16例AML患者和3例对照人骨髓CD34+细胞中Gfi-1蛋白的表达用Western-blot检测结果显示,在AML组和AML-CR组Gfi-1阳性(分别为1.26±0.14和0.65±0.04),均高于正常水平(0.24±0.02) (P<0. 0 1和P<0. 05) , AML组和AML-CR组相比,AML组Gfi-1表达又高于AML-CR组(P<0.05)。AML中各亚型(M1 ,M2 ,M3)之间Gfi-1表达情况的相比较,无统计学差异(P>0.05)。结论正常人CD34+细胞中Gfi-1有表达,在急性髓系白血病患者骨髓MNC CD34+细胞存在Gfi-1蛋白和mRNA表达,该表达在初治的急性髓系白血病患者显著增高。由于AML是造血干(祖)细胞性疾病,Gfi-1可能在AML发病中起一定作用。第三部分阿霉素对HL-60细胞Gfi-1表达的影响及其与相关凋亡基因的研究目的研究阿霉素对HL-60细胞增殖和凋亡的影响,并观察阿霉素处理后HL-60细胞Gfi-1及相关凋亡基因的表达变化的影响,探讨其抗白血病的分子机制。方法用不同浓度(0.1 mg/L,0.2 mg/L,0.5 mg/L,1.0 mg/L,2.0 mg/L,5.0mg/L)的阿霉素对处于对数生长期的HL-60细胞进行干预,未用阿霉素处理的HL-60细胞作为对照。24小时后,被干预细胞进行分析。采用MTT法测定阿霉素对HL-60细胞增殖的影响。凋亡细胞细胞形态学检测采用Hoechst33258 (8g/L)染色,荧光显微镜下观察细胞形态的变化;凋亡细胞用Annexin-V/PI双染后进行流式细胞分析计算实验凋亡细胞百分率,及DNA电泳方法测定DNA断裂的片段分析。运用RT-PCR分析阿霉素处理后HL-60细胞Gfi-1及相关凋亡基因Bax和Bcl-2 mRNA变化。Western blot实验分析HL-60细胞Gfi-1及相关凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白水平。结果阿霉素抑制HL-60细胞生长呈量效关系;在不同浓度的阿霉素作用下HL-60细胞逐渐出现了细胞凋亡,随着浓度的加大,在2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60细胞出现了典型的凋亡形态改变,包括细胞胞体变小、胞膜皱折及卷曲、细胞质出现空泡、核固缩、染色质密聚集成块并分布于核膜周边等;而当阿霉素浓度达到5.0mg/L时,HL-60细胞出现死亡;流式细胞仪检测出凋亡细胞百分率呈剂量依赖关系,在不同浓度的阿霉素作用下HL-60细胞凋亡率逐渐增大,在2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60细胞的凋亡率达到最大,为22.75±1.92%,而当阿霉素浓度达到5.0mg/L时,HL-60细胞的大部分死亡,凋亡率下降为7.43±0.56%;2.0 mg/L的阿霉素作用下HL-60细胞基因组DNA电泳出现典型的“梯”状条带;RT-PCR分析0mg/L,0.5 mg/L和2.0mg/L阿霉素处理后HL-60细胞Gfi-1mRNA及相关凋亡基因Bax和Bcl-2mRNA变化发现,Gfi-1的条带逐渐变得模糊,灰度扫描结果比值统计检测p <0.05 ,差异有显著性,说明Gfi-1 mRNA表达在阿霉素浓度越大时表达减少,Bax条带变得清晰,灰度扫描结果比值统计检测p <0.01 ,差异有显著性,表明Bax基因表达在阿霉素浓度增加时表达增加,与Gfi-1 mRNA表达呈负相关,Bcl-2 mRNA条带变化在0mg/L,0.5 mg/L,2.0mg/L不明显,灰度扫描结果比值统计检测p﹥0.05,差异无显著性,表明Bcl-2基因表达在阿霉素浓度在0mg/L ,0.5 mg/L与2.0 mg/L浓度下变化不大。Western blot结果显示HL-60细胞在阿霉素作用下其Gfi-1蛋白及相关凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白水平变化与Gfi-1 mRNA变化相似。结论阿霉素有抑制HL-60细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,HL-60细胞增殖抑制的机制可能与阿霉素能诱导其细胞凋亡有关;阿霉素诱导HL-60细胞凋亡的机制可能与干扰HL-60细胞Gfi-1蛋白表达并上调相关凋亡基因Bax蛋白水平有关。