流行性乙型脑炎(JE)是日本乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种重要的人兽共患病,猪是其中间放大宿主。JEV能通过多种途径感染宿主,我们前期研究也表明,JEV能在小鼠的肺脏复制并发生呼吸道传播,但是JEV导致呼吸道感染的分子机理尚不清楚。为此,本研究聚焦JEV与宿主呼吸道细胞的相互作用,探究JEV与猪肺泡巨噬细胞(PAM)互作蛋白并验证其对于JEV增殖的影响。本研究运用免疫共沉淀技术,首先筛选PAM细胞与JEV互作的宿主蛋白,并通过LC/MSMS质谱分析,确认成功筛选出宿主互作蛋白HSP70和ZBTB-38。然后,运用CRISPR/Cas9技术分别构建HSP70和ZBTB-38基因敲除细胞系,并通过DNA测序及间接免疫荧光检测其敲除效果,测序结果显示两基因的DNA序列均成功发生移码,间接免疫荧光结果显示均无特异性荧光出现,结果表明HSP70和ZBTB-38均被成功敲除。接下来,在基因敲除细胞系PAM.KO.HSP70和PAM.KO.ZBTB-38接种JEV后48h,JEV的mRNA水平分别下降了2.3倍和9倍,病毒蛋白表达水平分别下降了0.25倍和1倍;感染后72h,病毒粒子数量较对照组均有0.3倍的下降。最后,在PAM.KO.HSP70和PAM.KO.ZBTB-38细胞系中分别过表达HSP70和ZBTB-38基因并接种JEV,结果显示,JEV感染后48h,与对照组相比JEV的mRNA水平分别增加了0.9倍和1.5倍,病毒蛋白表达水平增加了8.5倍和0.5倍;感染后72h,病毒粒子数量也有提高。综上,本研究结果表明,PAM蛋白HSP70和ZBTB-38为JEV的互作蛋白,对JEV的增殖发挥正向调控作用。本研究结果将为JEV的致病机理研究,尤其是JEV感染导致的呼吸道传播,提供前期研究资料。