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丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种革兰氏染色阴性细菌,其可使40多种植物致病,引发植物的叶片、根茎等处疾病,丁香假单胞菌侵染植物主要通过Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ Secretion System, T3SS),Ⅲ型分泌系统编码过敏反应和致病性基因(Hypersensitive response and pathogenicity, hrp),hrp基因涉及到Ⅲ型分泌系统蛋白的分泌同时与Hrp菌毛的组装相关,hrpA基因编码Hrp菌毛的HrpA结构蛋白,通过影响HrpA结构蛋白功能能阻止Hrp菌毛的组装,降低或阻止丁香假单胞菌对植物体的侵害。本研究首先构建pGEX-6p-1-h,-pf4载体,并诱导表达GST-hrpA融合蛋白,GST-hrpA蛋白经割胶后用于小鼠免疫,同时将实验室已构建的pET32a-hrpA载体诱导表达TRX-HrpA融合蛋白,割胶纯化后测定蛋白浓度TRX-HrpA蛋白浓度为1.501mg/mL。然后从免疫后效价达到要求的小鼠脾脏中提取RNA,将RNA反转录获得cDNA,以cDNA为模板利用通用引物扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过交错延伸PCR将VH、VL和Linker ((G4S)3)按比例混合组装扩增单链抗体(scFv)基因,再单链抗体基因构建到噬菌体载体pCANTAB-5E上,获得库容量约为1.95×107pfu/mL的噬菌体抗体文库。最后应用噬菌体展示技术通过五轮的富集淘选获得两个与HrpA蛋白特异性结合的单链抗体,通过间接ELISA的方法对它们进行特异性和定量分析,最后得到一株单链抗体菌株用于转植物载体的构建,构建得到转植pC AMBIA-1300-221-scFv。