里氏木霉（Trichoderma reesei）是工业上常用的纤维素酶生产菌株,其分泌的纤维素酶组分中,β-葡萄糖苷酶的产量相对较低,是纤维素降解过程的限速酶,这极大的限制了纤维素酶整体的酶解效率。里氏木霉基因组中含有11个β-葡萄糖苷酶基因,除cel3a外,其它10个β-葡萄糖苷酶研究的很少,它们在纤维素酶的合成中发挥的作用是未知的。因此,对这些β-葡萄糖苷酶的作用机制进行研究,有利于理性的改造菌株、提高β-葡萄糖苷酶的产量、降低工业成本。另外,纤维素酶的诱导生成受复杂的信号调控网络调控,雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin,TOR）通路是协调真菌生长和代谢的重要枢纽,它在里氏木霉纤维素酶生产过程中发挥的作用是未知的,对其进行研究有利于更好的解析纤维素酶合成的调控机制,为理性改造菌株提供理论依据。在此基础上,本文研究了10个β-葡萄糖苷酶的功能、分布及分泌途径,以及雷帕霉素对里氏木霉纤维素酶合成、生长、形态、成孢、脂滴的影响及机制。具体工作内容如下:1.解析10种β-葡萄糖苷酶的功能和细胞分布。首先研究了β-葡萄糖苷酶过表达对纤维素酶生产的影响。过表达cel3b、cel3f和cel3g可以显著提高p NPGase酶活,168 h分别提高了121%、93%和156%。其次,研究了β-葡萄糖苷酶的分布形态,包括4种:CEL3B、CEL3E、CEL3F和CEL3G以分泌小泡的形式存在;CEL3H和CEL3J分布在整个细胞质中,有一定的蛋白聚集体;CEL1A和CEL3D分布在液泡中;CEL3C分布在细胞核中。最后,确定了7种胞外酶CEL1A、CEL3B、CEL3E、CEL3F、CEL3G、CEL3H和CEL3J和2种胞内酶CEL3C和CEL3D。CEL3B、CEL3E、CEL3F、CEL3H和CEL3G通过经典的内质网-高尔基体途径进行分泌,主要从顶体分泌;CEL1A通过液泡介导分泌;CEL3J以非传统途径进行分泌。2.对β-葡萄糖苷酶CEL1B的功能及作用机制进行研究。研究发现,过表达cel1b严重抑制了纤维素酶的分泌和菌丝的生长,并导致细胞形态发生变化。CEL1B被鉴定为胞内酶,主要位于液泡和细胞膜上。过表达cel1b使得胞内的p NPGase活性及胞内、外的葡萄糖含量显著下降。转录组测序分析显示,过表达cel1b影响了膜转运过程和内质网的功能。一些重要的糖转运子显著下调,使得葡萄糖、纤维二糖的吸收变慢。由此可见,β-葡萄糖苷酶CEL1B除了水解作用外,还具有其它功能,过表达cel1b通过抑制膜转运过程（尤其是糖的转运）和内质网的功能,进而抑制了纤维素酶的合成与分泌。3.β-葡萄糖苷酶CEL3J的功能及非传统途径分泌机制的研究。与其它β-葡萄糖苷酶相比,cel3j敲除对纤维素酶活的抑制程度最高,且不依赖于碳源。实验发现,过表达菌株Rcel3J纤维素酶各组分的分泌均对布雷菲德菌素A（BFA）不敏感。内质网共定位和Endo H酶切割实验证明CEL3J是以经过内质网、不经过高尔基体的非传统途径进行分泌。过表达cel3j导致TMED10、TSC2和sso2的转录水平显著提高,它们可能参与了CEL3J的合成与分泌。这些发现为揭示CEL3J具体的分泌机制提供了基础。4.雷帕霉素对里氏木霉产纤维素酶的影响及其机理研究。本研究发现,低浓度雷帕霉素对纤维素酶活有促进作用;而高浓度雷帕霉素对菌株有短暂的抑制现象,表现为纤维素酶活下降、细胞生长缓慢、菌丝形态发生变化以及孢子生成减少,但脂滴生成没有影响。高浓度雷帕霉素导致与纤维素降解相关的39个纤维素酶基因和7个转录因子的表达水平发生显著变化,绝大部分显著下调。tr TOR及TOR通路相关的基因变化不显著,说明里氏木霉对雷帕霉素具有很高的抗性。tr FKBP12的表达显著上调,通过敲除tr FKBP12,证明tr FKBP12介导了酶活的抑制,它是雷帕霉素的受体。