前言：　　 法布里病(Fabrydisease,FD,OMIM301500)是一种X连锁遗传疾病,因X染色体上编码α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase,α-GalA)基因(GLA,OMIM300644)突变,溶酶体内缺乏α-GalA活性,导致神经酞胺三聚己糖苷(globotriaoslyceramide,Ob3)为主的大量代谢物无法分解,堆积于细胞内,造成多器官系统损害的综合征。临床表现分为典型FD及非典型FD二类,典型FD以弥漫性角化性血管瘤、少汗,阵发性外周神经痛等症状为主,常在幼年发病;非典型FD则分为心脏、肾脏和神经三个变异型,常在中年后才发病,其中FD心脏变异型(Fabrydiseaseatypicalcardiacvariant)临床表现为肥厚性心肌病,尤其是左心室肥厚,多数患者携带IVS4+919G＞A基因突变(FD心脏变异型基因突变)。　　 本研究通过测定新生儿干燥血点(driedbloodspot,DBS)α-GalA酶活性值结合后续GLA基因测序确定方法来进行新生儿FD及可疑FD家族成员筛检工作。此外,我们还对原诊断为特发性肥厚型心肌病(idiopathichypertrophiccardiomyopanly,IHCM)的患者进行了WS4+919G＞A基因突变检测。　　 由于女性杂合子或WS4+919G＞A基因突变携带者的α-GalA酶活性减低不明显,临床症状轻微,因此采用测定α-GalA酶值方法往往不足以筛查此类人群。由此,本研究首次采用了高分辨熔解曲线分析技术(highresolutionmeltinganalysis,FIRM)取代传统α-GalA酶值测定方法筛查女性杂合子或IVS4+919G＞A基因突变携带者,以探索其在筛查此类人群中的应用价值。　　 对于FD基因突变携带者,是否该启动早期治疗目前尚有争议。以往认为Gb3与疾病进展和病情严重程度相关,但后来研究发现,FD患者,FD半合子或杂合子临床症状和血浆或尿液中Gb3含量无绝对平行关系,而与血浆或尿液中鞘氨醇三聚己糖苷(globotriaosylsphingosine,lysoGb3)含量呈正相关。由此,本论文通过检测FD典型及心脏病变异型患者病情进展中及治疗前后血浆lysoGb3和Gb3水平,发现lysoGb3比Gb3更有临床相关性,提示血浆lysoGb3水平可用于指导酶补充疗法(enzymereplacementtherapy,ERT)的启动时机。　　 研究对象和方法：　　 一、研究对象　　 (一)新生儿筛查、FD新生儿家族成员及门诊mCM病患检查　　 1、台湾自2008年1月至2011年6月出生的352,581名新生儿,男184,045名,女168,536名。　　 2、FD新生儿家族中家庭成员经筛查后,具任一种基因突变携带者或FD患者共253位,男54位,女199位。　　 3、心脏内科门诊288位诊断为IHCM患者,男198位,女90位。　　 (二)高分辨熔解曲线分析技术(HRM)进行GLA基因突变检测　　 由上述(一)研究筛选出的140位确诊为FD新生儿(男121位,女19位),进行HRM分析。13位正常人作为对照。　　 (三)血浆lysoGb3和Gb3检测　　 153位成年FD突变基因携带者,包括IVS4+919G＞A突变携带者92人(包括典型临床症状男性18位,前期临床症状男性27位,临床症状女性16位和前期临床症状女性31位),20位典型FD基因突变携带者(男性8位,女性12位)和41位新型基因突变携带者(男性19位,女性22位)。33位正常人作为对照。　　 二、研究方法　　 (一)新生儿筛查、FD新生儿家族成员及门诊mCM病患检查　　 1、新生儿筛查:下列(1)～(4),共4项检查　　 2、FD确诊新生儿的家族成员检查:下列(2)～(8),共7项检查。　　 3、门诊中IHCM病人检查:下列(2)～(8),共7项检查。　　 (1)DBS双步骤检测。　　 (2)α-GalA酶测定。　　 (3)IVS4+919G＞A突变基因检查。　　 (4)GL4基因测序。　　 (5)心脏科超声,心电图检查。　　 (6)肾脏科尿蛋白及肌酸酐检查。　　 (7)眼科检查。　　 (8)皮肤科检查。　　 (二)HRM进行GLA异常基因检测　　 1、自DBS中,提取DNA。　　 2、使用RocheLightCycler480system(Roche,YSA)分出1st外显子～7th外显子及IVS4的异常曲线。　　 (三)血浆lysoGb3和Gb3检测　　 1、以高效液相色谱法串联质谱仪,测量lysoGb3和Gb3。　　 2、统计方法:两组间差异使用学生t-检验进行评估。相关关系则以斯皮尔曼等级相关系数测试。当p值＜0.05时,认为有统计学意义。　　 结果：　　 一、新生儿筛查结果　　 1、经DBS双阳性及GLA突变基因检测,共140位新生儿确诊为FD新生儿(占1/2,518)。其中男121人(占1/1,521),女19人(占1/8,870)。　　 2、确诊FD新生儿中,带IVS4+919G＞A突变基因共113人(81%,113/140);带典型突变基因共6种,计6人(4.3%);带非典型突变基因共3种,计4人(2.90,6);带新型突变基因共9种,计17人(12.1%)。　　 二、FD新生儿阳性家族成员检查　　 共253位家族成员确诊为FD患者或带任一种突变基因之携带者,其中带IVS4+919G＞A突变基因者,共209人(82%);带典型突变基因共6种,计12人(4.7%);带非典型突变基因共3种,计8入(3.1%);带新型突变基因共9种,计24人(9.5%)。　　 三、心脏科门诊中IHCM结果　　 1、288位IHCM患者,其中55位经确诊为FD患者。其中带IVS4+919G＞A突变基因者,计32人(58%);带典型突变基因共4种,计19人(34.6%);带非典型突变基因1种,计4人(7.3%)。　　 2、病理学上变化:心肌细胞排列紊乱;细胞肥大;核内有大空泡;间质纤维化等。　　 四、HRM进行GLA突变基因检测　　 1、引物设计,包括外显子7-1、7-2及IVS4-1,分别涵盖旧的外显子7及IVS4+919G＞A,该方案可将杂合子及半合子FD病人,在HRM上清楚地分开。　　 2、自DBS中抽出的DNA浓度均在6ng/μl左右,满足HRM分析所需。故如应用HRM筛查,即可免除传统PCR前须定量DNA的耗时问题,相对可快速大量筛查检体。　　 五、血浆lysoGb3和Gb3检测　　 1、男、女IVS4+919G＞A组与对照组相较,lysoGb3较高,两者有明显差异。　　 2、男、女IVS4+919G＞A组与典型突变组相较,lysoGb3较低,两者有明显差异。　　 3、男、女性典型突变组相较,lysoGb3较高,两者有明显差异。　　 4、男性典型突变组和对照组间相较,lysoGb3较高,两者有明显差异。　　 5、男、女IVS4+919G＞A组和男、女对照组相较,Gb3浓度无显著差异。　　 6、当男性或女性FD患者年龄逐渐增加时,lysoGb3亦逐步升高。　　 7、心脏变异型FD患者,lysoGb3值在临床症状出现前即已升高。　　 8、心脏变异型FD男、女患者的左心室质量指数与lysoGb3浓度有线性关连。当男、女患者lysoGb3分别大于8.0nM与3.0nM时,都早已有肥厚型心肌病变。　　 9、15位接受ERT患者,治疗后的lysoGb3,均较治疗前有明显下降趋势。　　 10、6种新突变基因(R356Q,G360C,K391T,G104V,A108T,1232T)的患者及基因突变携带者,lysoGb3都明显升高(＞0.8nM)。　　 结论：　　 1、本论文共收集353,581名新生儿,涵盖全台湾55%的新生儿。　　 2、确诊为FD男性新生儿比例高达1/1,520。　　 3、所有FD新生儿,带IVS4+919G＞A比例高达8l%,从而迟发性心脏变异型FD男性新生儿高达1/1,880(1/1,520×81%)。　　 4、HRM是一项可快速筛选FD隐性女性基因突变携带者的灵敏方法。　　 5、使用HRM,无须于PCR前先定量DNA浓度,可缩短检测时间,大量筛查。　　 6、lysoGb3是比Gb3为更灵敏的追踪FD心脏病变严重度的指标。　　 7、lysoGb3在FD患者心肌纤维化前早已升高。故当发现lysoGb3浓度急遽上升时,必须及早启动ERT,以免心脏组织发生不可逆变化!