肺癌是当前全世界最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率居于各类恶性肿瘤之首，且呈显著的逐年上升趋势。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌发病比例的85%，由于其早期缺乏明显的临床症状，待患者就诊时往往已经处于病程的中晚期，5年生存率仅为15%左右。侵袭与转移是肿瘤致死的主要原因，而非小细胞肺癌的转移能力很强，约半数以上的NSCLC患者就诊时已经发生远处转移。因此，研究NSCLC的转移机制是延长NSCLC患者生存时间和提高其生活质量的最根本途径。　　形成转移的先决条件是有细胞从肿瘤原发灶脱离进入循环，从而在靶器官形成新的病灶，这些来自于原发灶、存在于血循环中的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)。目前研究己证实CTCs在肿瘤早期、治疗过程和转移复发中均可出现在肿瘤患者的外周血中，因此CTCs的检测和应用对肿瘤患者的辅助诊断、个体化治疗和预后评估都具有巨大的潜在价值。　　上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肿瘤细胞在细胞间微环境作用下，以间质细胞特性的获得伴随上皮细胞特性的缺失为主要特征的上皮细胞向间质细胞转化的生理或病理现象。肿瘤细胞借此适应其生长的外部微环境，从而获得干细胞的特性，在远处器官种植形成转移灶。目前常用的CTCs检测方法CellSearch系统：采用针对肿瘤细胞膜表面上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗原抗体反应原理，对NSCLC患者体内发生EMT肿瘤细胞的捕获能力相对较差，而文献报道和我们前期的研究证实NSCLC细胞转移入血需要EMT的过程，且发生了EMT的CTCs更易形成转移灶。因此，在富集NSCLC患者的CTCs时有效捕获发生EMT的肿瘤细胞不仅可以大大提高CTCs的阳性比例，更为CTCs在临床中分析和评估NSCLC的疗效及预后奠定基础。　　由于NSCLC缺乏特异性和敏感性俱佳的早期诊断标志物和能准确预测其预后的生物学指标，临床上常难以及时准确地为患者制定可靠有效的后续治疗方案，大大影响了NSCLC患者的生存期。MicroRNA-203是近年发现的一种内源性、非编码微小核糖核酸，通过特异性结合靶基因，影响下游遗传信息的翻译或转录，从而达到调控细胞增殖、分化和凋亡的作用，可作为抑癌或致癌因子参与调控肿瘤的发生与转移。前期研究发现，NSCLC患者的CTCs中microRNA-203表达水平与CTCs计数呈正相关，microRNA-203与NSCLC的转移与复发存在着密切关系，可为NSCLC的诊断和治疗提供全新的观察指标和治疗靶点，以期指导NSCLC的个体化治疗。　　目的：　　1、创立一种经济高效、方便快捷、无创全程的针对NSCLC患者的CTCs分选方法；　　2、利用该方法富集CTCs，观察对比CTCs阳性和阴性的NSCLC患者的病例资料，分析各组临床数据和CTCs阳性、阴性的关系，比较和观测CTCs阳性和阴性NSCLC患者的无进展生存期和总生存期；　　3、分析CTCs在评估NSCLC患者治疗方案的选择和预后中的应用价值；　　4、观察研究MicroRNA-203在NSCLC进程的作用及与临床资料的相关性。　　方法：　　1、为模拟NSCLC患者外周血中发生EMT的CTCs，应用TGF-pi诱导肺腺癌A549细胞株使其发生EMT，分别使用EpCAM抗体磁珠和CD45抗体磁珠两种免疫磁珠阳性和阴性富集EMT化A549细胞，比较免疫磁珠阳性和阴性富集法在CTCs富集中的差异，选择更适宜NSCLC的CTCs磁珠分选技术；　　2、利用荧光标记的免疫磁珠阴性富集法富集鉴定NSCLC患者的外周血CTCs，分析了91例NSCLC患者的外周血CTCs计数情况。每SmL NSCLC患者外周血CTCs计数>2判定为CTCs阳性，比较CTCs阳性和阴性亚组临床资料之间的统计学关系；　　3、根据RECIST评价标准对初治后2个周期的66例NSCLC患者进行影像学评估，分为进展和有效两组，以增减不同CTCs的个数来对应影像学评价结果，运用统计学方法分层计算有效检出率（即灵敏度）、进展检出率（即特异度）、准确度、有效预测值（即阳性预测值）和进展预测值（即阴性预测值），分析CTCs评估结果和影像学检查的一致性。　　4、通过qRT-PCR技术检测MicroRNA-203在肺癌细胞系与正常支气管上皮细胞之间的表达差异，观察microRNA-203对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；分别检测了96例NSCLC患者肿瘤及癌旁组织中microRNA-203的表达差异和16例NSCLC患者CTCs及肿瘤组织中microRNA-203的表达差异，比较了96例microRNA高表达和低表达组NSCLC患者之间无进展生存期和总生存期的差别。　　结果：　　1、使用荧光标记的免疫磁珠阴性富集法回收的EMT肺癌A549细胞得率显著高于以EpCAM为标记物的阳性分选方法，P＜0.001;　　2、91例NSCLC患者中，65例外周血CTCs计数＞2个/5ml，CTCs的阳性率为71.4%，CTCs数值范围为0-67个，中位数12个，30例健康志愿者和25例肺部良性疾病对照各检出1例CTCs阳性；　　3、CTCs的阳性率与NSCLC患者的临床分期及ECOG-ZPS评分有统计学意义，与年龄、性别、吸烟史、病理分型和基因突变情况无统计学意义；　　4、CTCs阴性NSCLC患者的中位PFS为10.0个月，中位OS为19.5个月；CTCs阳性NSCLC患者的中位PFS为7.6个月，中位OS为16.0个月。两组患者PFS与OS的Kaplan-Meier生存分析均显示P＜0.001;　　5、以影像学评价结果为金标准，以CTCs计数变化为每5ml外周血减少3个及以上时评价为“有效”（稳定+缓解）时，CTCs计数变化评价相对于影像学评价的进展检出率和准确度以及有效预测值最高，分别为91.7%、68.2%和80.0%。以CTCs计数变化为每Sml外周血增加2个及以上评价为“进展”时，CTCs计数变化评价相对于影像学评价的有效检出率和进展预测值最高，分别为90.0%和80.0%；　　6、MicroRNA-203在支气管上皮细胞和肺癌细胞系中存在表达差异，microRNA-203被抑制的肺癌细胞系的增殖和迁移能力均有所下降。在NSCLC患者CTCs、肿瘤组织和癌旁组织中，microRNA-203的表达水平存在显著差异，P＜0.001。MicroRNA-203高表达NSCLC患者组的中位PFS与OS分别为29.0个月和56.2个月，MicroRNA-203低表达组NSCLC患者的中位PFS与OS分别为48.5个月和72.0个月，Kaplan-Meier生存分析均显示P＜0.001。　　结论：　　1、通过荧光标记的免疫磁珠阴性富集技术对TGF-pi诱导的EMT肺癌A549细胞进行分选验证，证明了该技术更适合于发生EMT的NSCLC患者外周血CTCs的富集与分选；　　2、分析了91例NSCLC患者的外周血CTCs计数情况，CTCs的阳性率与NSCLC患者的肿瘤临床分期和ECOG-ZPS评分具有相关性，Ⅲ一Ⅳ期较Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者外周CTCs检出更高，P=0.009。ECOG-ZPS评分在2分的NSCLC患者CTCs检出率较评分在0-1分的NSCLC患者更高，P=0.047。CTCs阴性较CTCs阳性的NSCLC患者拥有更长的无进展生存期和总生存期；　　3、通过对66例影像学对应CTCs计数变化评价的NSCLC患者进行统计学分层计算，初治2个周期后的NSCLC患者可将每Sml外周血CTCs计数减少3个作为“有效”的评估因子和将每5ml外周血CTCs计数增加2作为“进展”的评估因子与影像学评价符合率最高，CTCs计数变化可作为NSCLC病情进展的辅助评价手段；　　4、MicroRNA-203在NSCLC患者的CTCs中呈高表达状态，对NSCLC的转移与复发具有一定的促进作用，microRNA-203高表达的NSCLC患者的无进展生存期和总生存期更短，应在其个体化治疗计划中尽早给予预防肿瘤转移和复发的干预。