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桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae,果实蝇属Bactrocera,为我国南方最重要的水果害虫之一,是我国植物检疫禁止进境的二类危险性害虫。本研究通过对桔小实蝇基因组DNA提取、引物设计和筛选、PCR扩增、目标序列测定,首次报道了桔小实蝇(中国种群)线粒体基因组全序列。
目前国内对实蝇科昆虫线粒体基因组全序列尚无研究报道。本研究通过通用引物PCR扩增和测序的方法测定了桔小实蝇线粒体基因组全序列结构。分别利用公开发表和自行设计的66条引物,从中筛选出22对用于基因组PCR扩增和测序分析(其中有一对引物用于克隆测序分析),共获得22条序列片段,相邻测序片段之间有部分碱基重叠,以保证末端序列的可信度。运用DNAStar等软件对这些序列片段进行拼接,得到桔小实蝇线粒体基因组全序列。
桔小实蝇线粒体基因组全长15915bp,为一环状DNA分子,由13个蛋白编码基因(COⅠ~Ⅲ、ND1~6和4L、Cytb、ATP8、ATP6),2个rRNA基因(12SrRNA、16SrRNA),22个tRNA基因和1个包含起始复制和转录信号的控制区(A+T-rich区)组成。COⅠ~Ⅲ、ND2、ND3、ND6、ATP6、ATP8和Cytb和13个tRNA基因从J链转录,其余的基因从N链转录。在桔小实蝇线粒体中,tRNA-Ser(UCN)基因发生倒位,从J链转移到N链上。
在桔小实蝇线粒体基因组全序列中,各碱基的总含量分别是39.3%A,16.2%C,10.2%G,34.3%T,AT总含量高达73.6%,表现出昆虫线粒体基因组中著名的“A+T偏好性”。J链中的蛋白编码基因具有近似的AT含量,其平均值分别为32.9%和37.6%,而N链中的蛋白编码基因的A的含量明显高于T的含量,两者数值分别是48.4%和26.5%。
在桔小实蝇mtDNA的22个tRNA中,除亮氨酸(Leu)和丝氨酸(Ser)对应的tRNA有2个以外,其他的氨基酸都只有一个tRNA与之对应。21个tRNA有规则的三叶草结构,仅tRNA-Ser(AGN)无D臂,由8个核苷酸取代了该位置。本研究在前人研究的基础上,对桔小实蝇、橄榄实蝇和地中海实蝇的线粒体基因组全序列进行分析比较。分别从蛋白编码基因的起始阅读框和终止密码子,蛋白编码基因和rRNA序列基因的同源性,碱基组成等方面对上述三种实蝇进行了比较,从分子水平角度证实桔小实蝇和橄榄实蝇的相似度要高于其与地中海实蝇的相似度。
本研究还以mtDNACOⅠ基因为例,对已公开发表的桔小实蝇、桔小实蝇复合种和近缘种部分基因序列进行比较,找出可用以区分桔小实蝇及其近缘种的特异性位点。