研究目的苯(C6H6)作为芳香烃毒物,既是油漆、喷漆、制鞋、制药和粘胶等行业中常用的有机溶剂,也是汽车尾气排放、室内装修和香烟烟雾中常见的环境污染物,因此职业暴露人群及普通人群均有机会接触苯,导致慢性苯中毒。慢性苯中毒所引起的血液系统损伤主要表现为白细胞减少和血小板减少,严重者可引起再生障碍性贫血/骨髓造血衰竭(Bone marrow failure,BMF)以及急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)。BMF主要表现为骨髓造血抑制引起的三系细胞减少,其毒性机制主要为苯及其代谢物如氢醌、苯酚在骨髓蓄积引起的造血干/祖细胞毒性,但其具体分子机制尚未完全阐明。流行病学研究表明苯中毒患者引起的AML通常发生于BMF之后,因此苯诱导的AML(Benzene-induced AML,BZ-AML)作为继发性白血病,具有与原发性白血病不同的机制特点,对其发病机制的研究有助于BZ-AML预防及治疗。炎症小体是一类分布于胞浆中的蛋白复合体。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)是目前研究最广泛及最具有特征性的炎症小体之一,在接受到内源性危险信号如ROS刺激后可活化并诱导免疫和炎性反应,因此在免疫防御及氧化应激方面具有重要意义。目前研究已经表明苯可引起ROS的过度生成,而ROS是NLRP3炎症小体的内源性激活物。那么,NLRP3炎症小体是否在苯诱导的氧化应激损伤中发挥作用?NLRP3炎症小体的活化与机体T淋巴细胞免疫功能损伤有无关联?通过调控与苯诱导的骨髓毒性相关的哪些分子通路发挥作用?在苯诱导的BMF和AML不同造血损伤中NLRP3的表达有无异同?现在尚不清楚。苯作为芳香烃毒物,主要与胞浆内的芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)结合,AhR是一种存在于胞浆中的配体激活的转录因子,苯作为外源性配体与胞浆中AhR结合后使其受到活化而进入细胞核中,进而启动目标基因的表达。目前研究证实AhR基因敲除小鼠在苯染毒暴露后不再引起骨髓造血毒性,表明AhR是苯诱导骨髓造血毒性的重要胞浆转录因子。目前认为苯诱导的造血毒性的主要机制有两点:1、苯与骨髓细胞浆内的AhR结合后直接作用于造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)引起细胞周期、基因调控、凋亡及氧化应激的异常,从而引起HSC的增殖期和静止期平衡异常;2、苯的代谢物如苯醌、氢醌与骨髓细胞的AhR结合后引起的细胞毒性反应。因此,AhR在苯的造血毒性机制中具有重要作用,但其具体分子调控机制尚不清楚。目前建立的苯诱导的造血损伤动物模型,在不同的种系、苯暴露剂量和途径及时间均进行了实验性研究,然而尚欠缺可完全复制的苯诱导的BMF、AML动物模型。我们在总结既往动物模型建立研究基础上,优化了苯暴露途径、剂量、时间,分别应用不同苯暴露的方案建立了拟人化的BMF和AML小鼠模型。在建模基础上,进一步明确苯与AhR结合后能否激活NLRP3炎症小体,及NLRP3异常表达在苯诱导骨髓细胞氧化损伤中的作用。此外,分别利用淫羊藿多糖(Epimedium polysaccharides,EPS)对苯诱导的 BMF 及鸦胆子苦醇(Brusatol)对苯诱导的AML进行药物治疗干预,进一步验证NLRP3的异常表达在苯诱导的BMF和AML不同造血毒性中的作用。为明确AhR介导的NLRP3炎症小体异常活化在苯诱导的造血毒性中的作用及EPS、Brusatol的临床应用提供了体内实验依据。本论文从以下两个方面进行了研究:一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策:在成功采用皮下注射苯的方法建立苯诱导的BMF小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓细胞中AhR及NLRP3炎症小体基因及蛋白表达均明显增高,表明AhR及NLRP3炎症小体的异常活化与骨髓造血衰竭密切相关;应用EPS能通过抗凋亡、抑制氧化应激、增强T淋巴细胞免疫功能及调节造血因子紊乱机制发挥改善骨髓造血衰竭的作用。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策:在成功采用吸入苯的方法建立BZ-AML小鼠模型基础上,本研究结果表明骨髓单个核细胞的NRF2及NLRP3炎症小体的异常活化与苯的致白血病作用密切相关,Brusatol通过抑制骨髓单个核细胞NRF2、NLRP3的基因及蛋白表达及诱导凋亡发挥抗白血病作用。研究方法一、AhR介导NLRP3信号传导通路在苯致BMF中作用机制研究及逆转对策1.50只CD1雄性小鼠分为建模组和对照组。建模组40只,分为4个亚组(10只/组):BMF组、EH组、EL组、CsA组,背部皮下注射苯油混合物,对照组(Control组)10只背部皮下注射等量玉米油,每周注射3次(周一、三、五),直至累计完成25次注射剂量。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.利用剪尾取血法采集外周血,兽用血细胞计数仪检测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)计数以及网织红细胞(RC)百分比、血红蛋白(Hgb)浓度的变化;利用HE染色观察外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学改变,通过与对照组比较,验证苯诱导的BMF小鼠的成模率。3.设计AhR、CYP1A1特异性引物,骨髓细胞经裂红及离心后获得骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs),利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测AhR及CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和BMMNCs中的差异表达。4.利用流式细胞仪检测BMMNCs中ROS的生成及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分比,qPCR和Western blot方法检测NLRP3的表达,研究NLRP3炎症小体异常表达在苯诱导的氧化应激损伤及免疫毒性中的意义。5.利用流式细胞仪检测BMMNCs的细胞周期、细胞凋亡率,Western blot方法检测D1型细胞周期蛋白(CyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶K4(Cyclin-dependent kinases K4,CDK4)蛋白的表达水平,研究细胞周期及细胞凋亡率的异常在苯诱导的BMF发病机制中的意义。6.建模成功后,给予 EH 组(EPS100mg/kg)、EL 组(EPS20mg/kg)、CsA 组(CsA1Omg/kg)小鼠采用灌胃给药治疗4周,BMF组及对照组给予等量生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续4周。通过观察各组小鼠体重变化,兽用血细胞分析仪检测小鼠血常规变化,显微镜观察外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理学变化,观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用。7.为明确EPS对苯诱导的BMF的治疗作用机制,本研究进一步利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞凋亡率的变化,通过qPCR方法观察BMMNCs 凋亡相关基因 Caspase-9、BCL-2、BAX 的表达,进一步 Western blot方法检测BAX蛋白的表达,观察EPS对凋亡的影响及机制。8.为明确EPS是否通过调控细胞周期发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs的细胞周期的变化,通过qPCR及Western blot方法检测BMMNC中CDK4基因和蛋白的表达,观察EPS对于细胞周期的影响。9.为明确EPS是否通过调控免疫及造血因子发挥治疗作用,本研究利用流式细胞仪及ELISA方法,检测各组小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化,以及外周血造血调控因子IL-2、IL-11和EPO浓度的变化,观察EPS对于T细胞亚群及细胞因子的影响。10.为明确EPS是否通过调节BMMNCs的氧化应激损伤发挥作用,本研究利用流式细胞仪检测各组小鼠BMMNCs中ROS水平变化,进一步qPCR检测BMMNCs中NLRP3炎症小体基因表达变化,观察EPS对于氧化应激损伤的影响。二、AhR介导NLRP3信号传导通路在BZ-AML中作用机制研究及逆转对策1.将30只雄性CBA/Ca小鼠随机分为3组(10只/组):对照组、BZ-AML组、Brusatol组。对照组(Control组)小鼠吸入空气,BZ-AML组、Brusatol组小鼠通过静式染毒柜吸入苯:苯浓度300ppm,每天6小时(6h/d),每周5天(5d/w),连续8周。实验期间,观察小鼠一般状态并记录体重的变化。2.通过血常规、外周血涂片、骨髓细胞学涂片及股骨病理学检查以及流式细胞仪检测CD34+、CD45+、CD13+、CD19+髓性白血病免疫分型,通过与对照组比较,验证BZ-AML小鼠的成模。3.流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs中的ROS生成及外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞的百分比。4.利用SPE-GC-MS检测BZ-AML小鼠血液、肝脏、肾脏、骨髓不同脏器苯及其代谢产物苯酚、氢醌等的浓度,分析了苯及其代谢物在不同脏器的分布在BZ-AML发病机制中的意义。5.利用流式细胞仪检测BZ-AML小鼠BMMNCs的细胞凋亡率及细胞周期的改变,分析凋亡和周期异常在其发病机制中的意义。6.利用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)及 Western blot 检测 BZ-AML小鼠骨髓组织及BMMNCs的NLRP3的表达,Western blot检测BZ-AML小鼠BMMNCs中AhR及CYP1A1的表达,观察AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML发病机制中的意义。7.确认建模成功后,Brusatol用无菌注射用水稀释后,Brusatol组给予腹腔注射Brusatol 4mg/kg,对照组及BZ-AML组均给予腹腔注射等体积的无菌注射用水,每天注射1次,5天/疗程,连续两个疗程。治疗结束后,Western blot检测 BZ-AML 小鼠 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、CDK4、CyclinDl、NLRP3等的表达变化,进一步验证AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中的调控机制。研究结果一、AhR介导的NLRP3信号通路在苯致BMF中作用机制及EPS逆转策略1.建立苯诱导的BMF小鼠模型首先我们利用CD1小鼠皮下注射苯(2mL/kg)的方法建立BMF小鼠模型。血常规结果显示,BMF模型组与对照组比较WBC、RBC、PLT计数、RC百分比及Hgb浓度明显下降;血涂片及骨髓细胞学涂片显示有核细胞均明显减少;股骨组织病理学检查显示骨髓增生度极度低下,造血面积明显减少。结果表明小鼠模型与人类苯诱导的BMF具有相似的造血损伤特征。2.AhR、CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠肝脏和骨髓中的差异性表达为了明确AhR和CYP1A1在苯诱导的造血毒性中作用,本研究首先检测了苯蓄积的主要靶器官肝脏和骨髓中AhR和CYP1A1的表达。qPCR方法检测基因表达和Western blot方法检测蛋白表达结果显示,与对照组相比,BMF组小鼠AhR和CYP1A1在骨髓和肝脏表达均明显升高,而在骨髓细胞的表达增高较肝脏更为显著。3.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的ROS增高及NLRP3炎症小体活化为了研究NLRP3在苯诱导的骨髓毒性中的作用,本研究在成功建立BMF模型基础上,首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS生成,明确苯暴露是否诱导小鼠骨髓氧化应激损伤。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的ROS产生明显增高。为观察苯诱导的ROS生成增加是否引起NLRP3的活化,本研究应用qPCR和Western blot检测了 BMMNCs的NLRP3的表达,mRNA及蛋白结果均表明BMF模型组BMMNCs的NLRP3表达明显增高。因此,苯诱导的骨髓细胞ROS增高引起的NLRP3炎症小体的活化与骨髓毒性密切相关。4.苯诱导BMF小鼠模型BMMNCs的S期阻滞及CDK4、CyclinD1蛋白表达降低为了观察苯暴露对BMF模型小鼠BMMNCs细胞周期的影响,本研究首先应用流式细胞仪检测了 BMMNCs的细胞周期的改变。发现与对照组相比,BMF模型组小鼠S期细胞百分比明显增加。进一步用Western blot检测周期调控相关的CDK4、Cyclin D1蛋白的表达,发现与对照组相比,BMF模型组小鼠BMMNCs的CDK4、Cyclin D1的蛋白表达明显降低。5.苯诱导BMF小鼠模型外周血造血因子IL-11、IL-2、EPO的失调为了观察苯诱导的BMF是否伴随造血因子的紊乱,本研究应用ELISA检测了血浆IL-11、IL-2、EPO的表达,发现与对照组相比,BMF模型组IL-2及EPO明显增高但IL-11降低,结果表明造血因子的紊乱在苯诱导的BMF发病机制中起一定作用。6.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的体重减轻为了观察EPS对苯诱导的BMF的治疗作用,我们在利用雄性CD1小鼠皮下注射苯的方法成功建立BMF小鼠模型后,给予不同剂量组的EPS灌胃治疗4周。发现与未治疗的BMF小鼠发生的进行性消瘦比较,EH组和EL组小鼠体重增加。这说明EPS具有缓解BMF引起的小鼠体重减轻的作用。7.EPS改善了苯诱导的BMF小鼠的造血损伤EPS治疗4周后,与未治疗的BMF小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血常规示WBC和PLT计数、Hgb浓度、RC百分比均增加,外周血细胞涂片、骨髓细胞涂片、股骨病理检测均显示骨髓有核细胞增加,这些结果表明,EPS能改善苯诱导的BMF。8.EPS通过下调BAX表达抑制苯诱导的BMMNCs过度凋亡因为观察到苯诱导BMF组小鼠的BMMNCs凋亡率增高,本研究进一步观察了 EPS治疗后小鼠BMMNCs凋亡率的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs凋亡率下降,进一步检测凋亡相关基因BAX、BCL-2、Caspase-9,发现EPS治疗组BMMNCs中BAX基因水平降低,Caspase-9、BCL-2则没有明显统计学差异。进一步蛋白结果验证也表明,与未治疗的BMF组比较,EH和EL治疗组小鼠的BMMNCs的BAX蛋白表达降低。这些结果表明,EPS是通过下调BAX基因及蛋白表达发挥抗凋亡作用。9.EPS通过上调CDK4减轻苯诱导的BMMNCs的S期阻滞为了观察EPS改善苯诱导的BMF是否与周期调控有关,本研究进一步检测了 EPS治疗后小鼠BMMNCs细胞周期的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的S期阻滞减轻,进一步检测CDK4的表达,我们发现EPS治疗组和药物阳性对照CsA组小鼠的BMMNCs的CDK4表达上调。这些结果表明,EPS治疗通过上调CDK4的蛋白表达减轻了苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的S期阻滞。10.EPS通过抑制NLRP3炎症小体的活化减轻苯诱导的氧化应激损伤体外研究已经证实EPS具有抗氧化应激作用,本研究进一步用流式细胞仪检测了 BMMNCs的ROS的水平变化,观察EPS改善苯诱导的BMF与氧化应激损伤的关系。结果发现EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的ROS的增高受到抑制。qPCR结果显示EH和EL治疗组小鼠BMMNCs的NLRP3的mRNA表达均明显降低。这些结果表明EPS可能通过抑制NLRP3炎症小体的活化发挥减轻苯诱导的骨髓细胞氧化应激损伤。11.EPS改善了外周血CD4+/CD8+T细胞比例及纠正造血因子的失衡为了观察EPS对苯诱导的BMF是否具有免疫调节作用,本研究进一步流式细胞仪检测了 EPS治疗后T淋巴细胞百分比及ELISA检测造血因子水平的变化。结果显示EPS治疗4周后,与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠的CD3+、CD4+细胞百分比及CD4+/CD8+比例明显增加;与未治疗的BMF组小鼠组比较,EH和EL治疗组小鼠血浆IL-11增高而IL-2和EPO降低。结果表明经EPS治疗后,苯诱导的BMF引起的T淋巴细胞免疫抑制及造血因子失衡得到缓解,EPS具有增强T淋巴细胞免疫功能和纠正造血因子失衡的作用。二、AhR介导的NLRP3信号通路在BZ-AML中作用机制及Brustol逆转策略1.采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型雄性CBA/Ca小鼠,采用静式吸入苯暴露染毒方法建立BZ-AML小鼠模型,与对照组比较,BZ-AML组小鼠血常规显示WBC、RBC和PLT降低,中性粒细胞百分比增高,外周血及骨髓细胞学涂片显示明显增多的原始细胞;肝脏病理检查显示原始细胞对肝窦的浸润伴脂肪细胞的增多;骨髓病理检查显示有原始细胞浸润骨膜,通过SPE-GC-MS分析苯及其代谢物,结果表明BZ-AML组与对照组相比,其血液、骨髓、肾脏、脾脏和肝脏中的含量明显高于对照组,BZ-AML组BMMNCs出现与人类相似的髓性白血病免疫分型表现:CD34+、CD13+、CD19-。2.苯诱导BZ-AML小鼠的免疫功能抑制建模完成后,应用流式细胞仪检测BZ-AML组和对照组小鼠外周血的T淋巴细胞亚群结果表明,BZ-AML组的CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+的T淋巴细胞明显低于对照组。表明BZ-AML的发病机制与苯诱导的免疫功能明显抑制密切相关。3.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2活化BZ-AML组与对照组比较,qPCR及Western blot结果表明BMMNCs的AhR、CYP1A1、NLRP3、NRF2基因和蛋白表达明显增高;免疫组化也表明骨髓组织的NRF2、NLRP3蛋白表达增强,研究结果证明在苯与AhR结合后可进一步诱导BMMNCs及股骨组织NRF2、NLRP3的活化,这可能是BZ-AML的发病机制之一。4.苯诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs凋亡受阻、G0/G1期阻滞BZ-AML组和对照组比较,流式细胞仪结果表明BMMNCs的细胞凋亡受阻、G0/G1期细胞百分比增高,研究结果证明苯诱导了 BMMNCs的凋亡阻遏及G0/G1期阻滞。5.Brusatol治疗能抑制BZ-AML组小鼠BMMNCs的NLRP3及NRF2的活化经Brusatol治疗10天后,1HC及Western blot结果表明与BZ-AML组小鼠比较,Brusatol组小鼠NLRP3、KEAP1及NRF2蛋白的表达明显降低,结果表明Brusatol通过抑制NLRP3及KEAP1-NRF2的活化发挥抗白血病作用。6.Brusatol治疗能诱导BZ-AML小鼠BMMNCs的凋亡经Brusatol治疗10天后,流式细胞仪检测对照组、BZ-AML组、Brusatol组小鼠 BMMNCs 晚期凋亡率分别为 4.27±0.42%,1.20±0.50%,2.14±0.28%。结果表明,Brusatol能诱导BZ-AML组小鼠BMMNCs的凋亡,从而发挥抗白血病作用。研究结论一、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在苯诱导的BMF中发挥重要作用1.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的ROS过度生成,ROS可引起NLRP3炎症小体的活化;2.苯诱导的BMF小鼠BMMNCs的凋亡率增加和S期阻滞;3.AhR和CYP1A1在肝脏和骨髓高表达,但骨髓表达增高更明显,其组织的差异表达是苯诱导的BMF造血毒性的重要机制;4.外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞降低及造血因子IL-11、IL-2和EPO的失衡与苯诱导的BMF免疫毒性密切相关。二、EPS通过抗凋亡、抗炎、减轻周期阻滞、增强T细胞免疫功能发挥改善骨髓造血衰竭的作用1.EPS能通过的下调BMMNCs的BAX基因和蛋白的表达发挥抗凋亡作用;2.EPS能通过抑制BMMNCs的NLRP3炎症小体活化、降低ROS生成发挥抗氧化应激作用;3.EPS能通过上调BMMNCs的CDK4蛋白表达减轻S期阻滞的作用;4.EPS通过增加外周血CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比及改善IL-11、IL-2和EPO造血因子的失衡,发挥增强免疫的作用。三、利用CBA/Ca小鼠采用吸入法成功建立BZ-AML小鼠模型1.外周血及骨髓细胞学涂片、肝脏及骨髓病理检查均显示原始细胞增多,结合骨髓细胞的白血病免疫分析:CD34+、CD13+、CD19-,验证了拟人化的BZ-AML动物模型成功构建;2.BZ-AML 小鼠外周血的 CD3+、CD4+、CD8+、CD80+、CD86+T 淋巴细胞免疫功能明显受抑制;3.BZ-AML小鼠存在BMMNCs的凋亡抑制及G0/G1期的阻滞。四、AhR介导的NLRP3炎症小体活化在BZ-AML中发挥调控作用1.BZ-AML 小鼠的 BMMNCs 的 AhR、CYP1A1、NRF2、NLRP3 均表达增强,表明苯和AhR结合后引起了 NRF2、NLRP3活性增强;2.Brusatol通过诱导BMMNCs凋亡增加发挥抗白血病作用;Brusatol明显降低了NLRP3、KEAP1-NRF2相关基因和蛋白的表达,表明Brusatol抗白血病机制与抑制NLRP3炎症小体、KEAP1-NRF2的活化密切相关。创新性和意义1.明确了在苯诱导的BMF小鼠模型中,苯暴露引起BMMNCs的ROS过度生成并伴随NLRP3炎症小体的活化;2.体内实验证明了 EPS、Brusatol对苯诱导的BMF、AML具有治疗作用;3.体内实验证明EPS、Brusatol可能通过抑制NLRP3活性发挥改善骨髓造血毒性的作用;4.发现了 AhR和CYP1A1在苯诱导的BMF小鼠的肝脏和骨髓的差异性表达,其在骨髓的增高更为显著,为苯的造血毒性机制提供了新观点;5.研究结果为EPS、Brusatol治疗苯诱导的BMF、AML不同造血毒性的临床应用奠定了实验基础。局限性1.未进行体外细胞培养深入探究苯诱导的ROS生成与NLRP3炎症小体的活化的剂量-效应关系,故ROS水平与NLRP3炎症小体活化的浓度-效应关系尚未确定;2.由于时间的关系,未深入研究苯与胞浆的AhR结合后是如何调控胞内NLRP3活化的具体分子通路。