【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称为猪的蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,该病传播迅速,
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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称为猪的蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病,该病传播迅速,临床症状表现为母猪晚期早产、流产、死胎、木乃伊胎,仔猪存活率下降和育成猪的呼吸道疾病等。PRRSV基因组全长约为15kb,有8个读码框。ORF2、ORF3和ORF4分别编码病毒的次要结构蛋白GP2、GP3和GP4,ORF5、ORF6和ORF7分别编码病毒的主要结构蛋白E蛋白、M蛋白和N蛋白。E、M和N蛋白具有较好的免疫原性,是构成PRRSV的主要抗原。PRRSV在全世界范围内广泛流行,造成了重大的经济损失,严重危害了养猪业的发展。各国学者纷纷研制各种疫苗,来控制PRRSV的蔓延,腺病毒载体因其自身的优越性,由此受到广泛的关注和应用。本试验利用复制缺陷型腺病毒载体首次成功构建了共表达PRRSV囊膜蛋白(EP)、基质蛋白(MP)和核蛋白(NP)的重组腺病毒。在构建重组腺病毒的试验中,首先用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法分别扩增出PRRSV的E基因、M基因和N基因,经测序正确后将三者用具有自裂解功能的口蹄疫病毒2A多肽的核苷酸序列依次串联起来,然后将连接好的E-2A-M-2A-N核苷酸序列克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经PCR鉴定和酶切鉴定后筛选出了重组质粒pAdTrack-CMV/E-2A-M-2A-N,将此重组质粒和腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,获得了含有外源基因的重组腺病毒质粒pAd/E-2A-M-2A-N;最后将重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后转染HEK-293细胞,得到含有E-2A-M-2A-N基因的重组腺病毒。对重组腺病毒进行传代培养,之后提取4、6、8、10代病毒的基因组进行PCR扩增,证实外源基因在重组腺病毒中能够稳定遗传。最后,用蚀斑测定和TCID50的方法来检测病毒的毒价。本试验为研制共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因、M基因和N基因的复制缺陷型腺病毒活载体疫苗奠定了基础。
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