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第一部分基于高通量测序的胰腺癌组织差异表达lncRNA的筛选及结果验证
目的:利用高通量测序技术筛选出人胰腺癌组织及非癌胰腺组织之间差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，并进行数据分析，为后续的研究奠定基础，以期为胰腺癌的分子生物治疗提供潜在靶点。
方法:(1)收集苏州大学附属第一医院普外科行胰腺癌根治性切除患者的癌组织标本及其配对的非癌胰腺组织，以及因非胰腺癌而行胰十二指肠切除患者的胰腺正常组织，并记录所有患者的临床病理特征。(2)选取其中6例胰腺癌组织及其配对非癌胰腺组织行高通量转录本测序，根据转录本测序的结果，分析胰腺癌组织和非癌胰腺组织差异表达的lncRNA，筛选胰腺癌组织lncRNA差异表达谱中上调和下调有显著差异的lncRNA。(3)从上述的胰腺癌组织lncRNA差异表达谱中挑选4种差异表达显著的lncRNA(ENST00000567563，NR 036469， NR_ 047568，ENST00000532061)，扩大样本量，运用qRT-PCR技术检测其在胰腺癌及非癌胰腺组织中的表达情况。(4)选取NR_036469/lincRNA-p21这一指标，根据lincRNA-p21在121例胰腺癌患者肿瘤组织中的表达水平，分析lincRNA-p21的表达水平与患者性别、年龄、T分期、N分期、临床TNM分期、肿瘤位置、是否存在血管侵犯、肿瘤细胞分化程度等临床病理特征之间的关系。
结果:(1)通过对6组胰腺癌和非癌胰腺组织样本的高通量测序，共筛选出50个一致性较高的差异表达lncRNAs，其中上调的有33个，下调的有17个。(2)经qRT-PCR验证的4个lncRNA(ENST00000567563，NR_036469/ lincRNA-p21，NR_047568，ENST00000532061)其表达情况与测序结果符合，挑选NR036469/lincRNA-p21作为后续的研究对象。(3)与非癌胰腺组织相比，lincRNA-p21在胰腺癌组织中低表达，统计分析显示LincRNA-p21的表达量差异与患者的T分期，TNM分期、有无血管侵犯以及肿瘤细胞分化程度有关(P＜0.05)，与患者的性别，年龄，肿瘤部位，N分期无关(P＞0.05)。
结论:本研究通过高通量测序的方法，获得胰腺癌组织的lncRNA差异表达谱。LincRNA-p21在胰腺癌组织中的表达量要低于非癌胰腺组织;LincRNA-p21低表达的胰腺癌患者具有较高的T分期和TNM分期，其肿瘤细胞分化程度更低，且易于发生血管侵犯。
第二部分LincRNA-p21在胰腺癌细胞中的体内外功能实验验证
目的:观察上调、下调lincRNA-p21的表达后对胰腺癌细胞恶性表型的影响。
方法:(1)qRT-PCR检测四种胰腺癌细胞株中lincRNA-p21的表达水平。(2)构建过表达lincRNA-p21的慢病毒表达载体，侵染人胰腺癌Patu8988细胞，获得稳定高表达lincRNA-p21的Patu8988细胞株(lincRNA-p21);构建lincRNA-p21敲低的慢病毒表达载体，侵染人胰腺癌SW1990细胞，获得稳定敲低lincRNA-p21的SW1990细胞株(sh-lincRNA-p21)。(3)应用CCK8、平板克隆实验、Transwell实验及划痕实验等方法观察lincRNA-p21对胰腺癌细胞体外增殖、侵袭和迁移的影响。(4)构建荷瘤裸鼠模型。裸鼠皮下成瘤及原位成瘤实验检测lincRNA-p21对胰腺癌细胞体内成瘤能力的影响，并观察原位成瘤实验中，胰腺癌细胞对邻近脏器的侵袭能力变化。
结果:(1)四种胰腺癌细胞中均可检测到lincRNA-p21的表达，LincRNA-p21在SW1990细胞中的表达量相对最高，在Patu8988细胞中的表达量相对最低。(2)qRT-PCR分析结果显示，转染慢病毒过表达载体后Patu8988细胞中lincRNA-p21的表达水平显著提高，过表达建株成功;转染慢病毒shRNA序列载体后，shRNA1敲低组，shRNA2敲低组，shRNA3敲低组均有较好的敲低效率，P＜0.01。其中shRNA3敲低效率最高。(3)CCK8检测细胞增殖活性，结果表明，过表达lincRNA-p21组Patu8988细胞的增殖速率在48小时后即出现显著抑制(P＜0.05);敲低lincRNA-p21后，与sh-NC组相比，sh-lincRNA-p21组SW1990细胞的增殖能力在48小时后即出现显著增强(P＜0.05)。(4)平板克隆实验结果显示:过表达lincRNA-p21后，其形成克隆的数目明显下降，胰腺癌细胞体外致瘤能力减弱(P＜0.05);敲低lincRNA-p21后，其形成克隆的数目明显升高，胰腺癌细胞的体外致瘤能力增强(P＜0.05)。(5)Transwell侵袭试验结果表明，过表达组细胞平均每个视野穿过的细胞数明显少于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);敲低lincRNA-p21后，平均每个视野穿过的细胞数明显多于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。过表达lincRNA-p21对Patu8988细胞侵袭运动能力的抑制率达到46.3％。(6)划痕实验结果显示lincRNA-p21过表达后Patu8988细胞的迁移距离显著缩短(P＜0.05)，划痕修复能力减弱;敲低lincRNA-p21后，SW1990细胞的迁移距离加快(P＜0.05)，划痕修复能力增强。(7)体内皮下成瘤及原位成瘤实验中，与对照组相比，过表达组皮下肿瘤的重量均明显低于对照组，P＜0.05，差异有统计学意义。lincRNA-p21过表达能显著抑制胰腺癌细胞增殖生长的能力;此外，在原位成瘤实验中，lincRNA-p21过表达组发生脾脏侵犯的例数要明显少于对照组。
结论:在胰腺癌细胞Patu8988中上调LincRNA-p21的表达，可抑制胰腺癌细胞的增殖，减弱胰腺癌细胞的体外侵袭和迁移能力;在胰腺癌细胞SW1990中下调LincRNA-p21的表达，可促进胰腺癌细胞的增殖，增强胰腺癌细胞的体外侵袭和迁移能力。lincRNA-p21体内皮下成瘤及原位成瘤实验表明lincRNA-p21具有抑制胰腺癌细胞增殖及癌细胞向周围转移的作用。
第三部分基于生物信息学分析的lincRNA-p21抑制胰腺癌作用的机制预测及验证
目的:预测并实验验证lincRNA-p21发挥抑癌作用可能的相关上下游分子及通路，揭示lincRNA-p21调控胰腺癌增殖和侵袭的分子机制。
方法:(1)通过芯片检测并分析在Vector,lincRNA-p21，sh-NC，sh-lincRNA-p21四种细胞系中，mRNA的表达量变化情况，运用生物信息学分析技术预测lincRNA-p21可能的相关上下游分子及通路，根据RNA-pulldown实验的结果筛选LincRNA-p21可能的直接作用蛋白。(2)Westernblot法检测上调和下调lincRNA-p21后，Wrt通路相关下游蛋白的表达变化。(3)运用生物信息学分析技术预测lineRNA-p21调控β-catenin蛋白的可能机制。通过使用蛋白质合成抑制剂(CHX)、蛋白酶体抑制剂(MG132)及蛋白泛素化免疫共沉淀实验验证lincRNA-p21降解β-catenin蛋白的机制。(4)通过qRT-PCR、免疫荧光、核浆分离和Westernblot技术检测胰腺癌细胞中lincRNA-p21调控β-catenin蛋白及其磷酸化的情况，研究lincRNA-p21介导β-catenin泛素化降解的分子机制。(5)体内原位成瘤实验验证lincRNA-p21对β-catenin蛋白的负性调控。(6)TCGA和GEO数据库分析及临床标本免疫组化检测，研究lincRNA-p21表达与CTNNB1基因及β-catenin蛋白表达的相关性。
结果:(1)LincRNA-p21定位于胰腺癌细胞的细胞质，其抑制胰腺癌的作用与Wnt/β-catenin通路有关，lincRNA-p21在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用，并影响其下游CyclinD1、MMP7、CD44、AXIN2的表达。(2)RNA-pulldown实验结果表明，lincRNA-p21可直接与beta-catenin蛋白相互结合。(3)生物信息学分析中发现，lincRNA-p21的表达变化后，发生相应表达变化的mRNA进行基因注释分析后富集于泛素化降解(ubiquitin-like protein transferase activity)。使用蛋白合成抑制剂CHX处理细胞后，过表达lincRNA-p21组细胞β-catenin蛋白降解的速度加快，高于对照组(P＜0.05)。使用MG132处理细胞后，对照组与高表达lincRNA-p21组β-catenin蛋白量均明显升高(P＜0.05)，且MG132能够逆转lincRNA-p21过表达后引起的β-catenin蛋白减少。β-catenin蛋白泛素化免疫共沉淀实验显示，过表达lincRNA-p21后，泛素化条带明显加强，表明过表达lincRNA-p21后，β-catenin的泛素化水平明显增高。(4)qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光、核浆分离等实验证实，lincRNA-p21在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用;lincRNA-p21可同时影响细胞质及细胞核中β-catenin蛋白的表达。(5)过表达lincRNA-p21后可促进Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化，同理，敲低lincRNA-p21后，抑制了Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化;而过表达lincRNA-p21后Y142位点的磷酸化受到了抑制，敲低lincRNA-p21后，Y142位点的磷酸化得到了增强。Thr41/Ser45、Ser675位点的磷酸化与lincRNA-p21的表达无关。(6)体内原位成瘤动物实验中，lincRNA-p21高表达的瘤块，其β-catenin蛋白的表达量降低，与体外细胞实验结果相符。(7)数据库及临床标本免疫组化检测发现，CTNNB1基因和β-catenin蛋白在胰腺癌组织中均呈高表达，lincRNA-p21表达与β-catenin表达呈负相关，相关系数为-0.3063。lincRNA-p21低表达时，β-catenin表达增加，在细胞质和细胞核中均有表达，以细胞核为主;在lincRNA-p21表达升高后，细胞质和细胞核中β-catenin蛋白的表达均降低，细胞核中β-catenin蛋白降低更为明显。
结论:LincRNA-p21定位于细胞质，在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用;LincRNA-p21抑制胰腺癌的作用与Wnt/β-catenin通路有关，过表达lincRNA-p21后，Wnt/β-catenin通路关闭或失活。敲低lincRNA-p21后，可激活Wnt/β-catenin通路。CTNNB1基因和β-catenin蛋白在胰腺癌组织中均呈高表达，lincRNA-p21表达与β-catenin表达呈负相关，细胞内lincRNA-p21的表达变化同时影响细胞质及细胞核中β-catenin蛋白的表达，其对细胞核中β-catenin蛋白的表达影响更大。LincRNA-p21通过增强β-catenin蛋白Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化修饰，从而介导其泛素化-蛋白酶体途径降解β-catenin，抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。
目的:利用高通量测序技术筛选出人胰腺癌组织及非癌胰腺组织之间差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，并进行数据分析，为后续的研究奠定基础，以期为胰腺癌的分子生物治疗提供潜在靶点。
方法:(1)收集苏州大学附属第一医院普外科行胰腺癌根治性切除患者的癌组织标本及其配对的非癌胰腺组织，以及因非胰腺癌而行胰十二指肠切除患者的胰腺正常组织，并记录所有患者的临床病理特征。(2)选取其中6例胰腺癌组织及其配对非癌胰腺组织行高通量转录本测序，根据转录本测序的结果，分析胰腺癌组织和非癌胰腺组织差异表达的lncRNA，筛选胰腺癌组织lncRNA差异表达谱中上调和下调有显著差异的lncRNA。(3)从上述的胰腺癌组织lncRNA差异表达谱中挑选4种差异表达显著的lncRNA(ENST00000567563，NR 036469， NR_ 047568，ENST00000532061)，扩大样本量，运用qRT-PCR技术检测其在胰腺癌及非癌胰腺组织中的表达情况。(4)选取NR_036469/lincRNA-p21这一指标，根据lincRNA-p21在121例胰腺癌患者肿瘤组织中的表达水平，分析lincRNA-p21的表达水平与患者性别、年龄、T分期、N分期、临床TNM分期、肿瘤位置、是否存在血管侵犯、肿瘤细胞分化程度等临床病理特征之间的关系。
结果:(1)通过对6组胰腺癌和非癌胰腺组织样本的高通量测序，共筛选出50个一致性较高的差异表达lncRNAs，其中上调的有33个，下调的有17个。(2)经qRT-PCR验证的4个lncRNA(ENST00000567563，NR_036469/ lincRNA-p21，NR_047568，ENST00000532061)其表达情况与测序结果符合，挑选NR036469/lincRNA-p21作为后续的研究对象。(3)与非癌胰腺组织相比，lincRNA-p21在胰腺癌组织中低表达，统计分析显示LincRNA-p21的表达量差异与患者的T分期，TNM分期、有无血管侵犯以及肿瘤细胞分化程度有关(P＜0.05)，与患者的性别，年龄，肿瘤部位，N分期无关(P＞0.05)。
结论:本研究通过高通量测序的方法，获得胰腺癌组织的lncRNA差异表达谱。LincRNA-p21在胰腺癌组织中的表达量要低于非癌胰腺组织;LincRNA-p21低表达的胰腺癌患者具有较高的T分期和TNM分期，其肿瘤细胞分化程度更低，且易于发生血管侵犯。
第二部分LincRNA-p21在胰腺癌细胞中的体内外功能实验验证
目的:观察上调、下调lincRNA-p21的表达后对胰腺癌细胞恶性表型的影响。
方法:(1)qRT-PCR检测四种胰腺癌细胞株中lincRNA-p21的表达水平。(2)构建过表达lincRNA-p21的慢病毒表达载体，侵染人胰腺癌Patu8988细胞，获得稳定高表达lincRNA-p21的Patu8988细胞株(lincRNA-p21);构建lincRNA-p21敲低的慢病毒表达载体，侵染人胰腺癌SW1990细胞，获得稳定敲低lincRNA-p21的SW1990细胞株(sh-lincRNA-p21)。(3)应用CCK8、平板克隆实验、Transwell实验及划痕实验等方法观察lincRNA-p21对胰腺癌细胞体外增殖、侵袭和迁移的影响。(4)构建荷瘤裸鼠模型。裸鼠皮下成瘤及原位成瘤实验检测lincRNA-p21对胰腺癌细胞体内成瘤能力的影响，并观察原位成瘤实验中，胰腺癌细胞对邻近脏器的侵袭能力变化。
结果:(1)四种胰腺癌细胞中均可检测到lincRNA-p21的表达，LincRNA-p21在SW1990细胞中的表达量相对最高，在Patu8988细胞中的表达量相对最低。(2)qRT-PCR分析结果显示，转染慢病毒过表达载体后Patu8988细胞中lincRNA-p21的表达水平显著提高，过表达建株成功;转染慢病毒shRNA序列载体后，shRNA1敲低组，shRNA2敲低组，shRNA3敲低组均有较好的敲低效率，P＜0.01。其中shRNA3敲低效率最高。(3)CCK8检测细胞增殖活性，结果表明，过表达lincRNA-p21组Patu8988细胞的增殖速率在48小时后即出现显著抑制(P＜0.05);敲低lincRNA-p21后，与sh-NC组相比，sh-lincRNA-p21组SW1990细胞的增殖能力在48小时后即出现显著增强(P＜0.05)。(4)平板克隆实验结果显示:过表达lincRNA-p21后，其形成克隆的数目明显下降，胰腺癌细胞体外致瘤能力减弱(P＜0.05);敲低lincRNA-p21后，其形成克隆的数目明显升高，胰腺癌细胞的体外致瘤能力增强(P＜0.05)。(5)Transwell侵袭试验结果表明，过表达组细胞平均每个视野穿过的细胞数明显少于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);敲低lincRNA-p21后，平均每个视野穿过的细胞数明显多于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。过表达lincRNA-p21对Patu8988细胞侵袭运动能力的抑制率达到46.3％。(6)划痕实验结果显示lincRNA-p21过表达后Patu8988细胞的迁移距离显著缩短(P＜0.05)，划痕修复能力减弱;敲低lincRNA-p21后，SW1990细胞的迁移距离加快(P＜0.05)，划痕修复能力增强。(7)体内皮下成瘤及原位成瘤实验中，与对照组相比，过表达组皮下肿瘤的重量均明显低于对照组，P＜0.05，差异有统计学意义。lincRNA-p21过表达能显著抑制胰腺癌细胞增殖生长的能力;此外，在原位成瘤实验中，lincRNA-p21过表达组发生脾脏侵犯的例数要明显少于对照组。
结论:在胰腺癌细胞Patu8988中上调LincRNA-p21的表达，可抑制胰腺癌细胞的增殖，减弱胰腺癌细胞的体外侵袭和迁移能力;在胰腺癌细胞SW1990中下调LincRNA-p21的表达，可促进胰腺癌细胞的增殖，增强胰腺癌细胞的体外侵袭和迁移能力。lincRNA-p21体内皮下成瘤及原位成瘤实验表明lincRNA-p21具有抑制胰腺癌细胞增殖及癌细胞向周围转移的作用。
第三部分基于生物信息学分析的lincRNA-p21抑制胰腺癌作用的机制预测及验证
目的:预测并实验验证lincRNA-p21发挥抑癌作用可能的相关上下游分子及通路，揭示lincRNA-p21调控胰腺癌增殖和侵袭的分子机制。
方法:(1)通过芯片检测并分析在Vector,lincRNA-p21，sh-NC，sh-lincRNA-p21四种细胞系中，mRNA的表达量变化情况，运用生物信息学分析技术预测lincRNA-p21可能的相关上下游分子及通路，根据RNA-pulldown实验的结果筛选LincRNA-p21可能的直接作用蛋白。(2)Westernblot法检测上调和下调lincRNA-p21后，Wrt通路相关下游蛋白的表达变化。(3)运用生物信息学分析技术预测lineRNA-p21调控β-catenin蛋白的可能机制。通过使用蛋白质合成抑制剂(CHX)、蛋白酶体抑制剂(MG132)及蛋白泛素化免疫共沉淀实验验证lincRNA-p21降解β-catenin蛋白的机制。(4)通过qRT-PCR、免疫荧光、核浆分离和Westernblot技术检测胰腺癌细胞中lincRNA-p21调控β-catenin蛋白及其磷酸化的情况，研究lincRNA-p21介导β-catenin泛素化降解的分子机制。(5)体内原位成瘤实验验证lincRNA-p21对β-catenin蛋白的负性调控。(6)TCGA和GEO数据库分析及临床标本免疫组化检测，研究lincRNA-p21表达与CTNNB1基因及β-catenin蛋白表达的相关性。
结果:(1)LincRNA-p21定位于胰腺癌细胞的细胞质，其抑制胰腺癌的作用与Wnt/β-catenin通路有关，lincRNA-p21在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用，并影响其下游CyclinD1、MMP7、CD44、AXIN2的表达。(2)RNA-pulldown实验结果表明，lincRNA-p21可直接与beta-catenin蛋白相互结合。(3)生物信息学分析中发现，lincRNA-p21的表达变化后，发生相应表达变化的mRNA进行基因注释分析后富集于泛素化降解(ubiquitin-like protein transferase activity)。使用蛋白合成抑制剂CHX处理细胞后，过表达lincRNA-p21组细胞β-catenin蛋白降解的速度加快，高于对照组(P＜0.05)。使用MG132处理细胞后，对照组与高表达lincRNA-p21组β-catenin蛋白量均明显升高(P＜0.05)，且MG132能够逆转lincRNA-p21过表达后引起的β-catenin蛋白减少。β-catenin蛋白泛素化免疫共沉淀实验显示，过表达lincRNA-p21后，泛素化条带明显加强，表明过表达lincRNA-p21后，β-catenin的泛素化水平明显增高。(4)qRT-PCR、Westernblot、免疫荧光、核浆分离等实验证实，lincRNA-p21在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用;lincRNA-p21可同时影响细胞质及细胞核中β-catenin蛋白的表达。(5)过表达lincRNA-p21后可促进Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化，同理，敲低lincRNA-p21后，抑制了Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化;而过表达lincRNA-p21后Y142位点的磷酸化受到了抑制，敲低lincRNA-p21后，Y142位点的磷酸化得到了增强。Thr41/Ser45、Ser675位点的磷酸化与lincRNA-p21的表达无关。(6)体内原位成瘤动物实验中，lincRNA-p21高表达的瘤块，其β-catenin蛋白的表达量降低，与体外细胞实验结果相符。(7)数据库及临床标本免疫组化检测发现，CTNNB1基因和β-catenin蛋白在胰腺癌组织中均呈高表达，lincRNA-p21表达与β-catenin表达呈负相关，相关系数为-0.3063。lincRNA-p21低表达时，β-catenin表达增加，在细胞质和细胞核中均有表达，以细胞核为主;在lincRNA-p21表达升高后，细胞质和细胞核中β-catenin蛋白的表达均降低，细胞核中β-catenin蛋白降低更为明显。
结论:LincRNA-p21定位于细胞质，在转录后水平对β-catenin的起负性调控作用;LincRNA-p21抑制胰腺癌的作用与Wnt/β-catenin通路有关，过表达lincRNA-p21后，Wnt/β-catenin通路关闭或失活。敲低lincRNA-p21后，可激活Wnt/β-catenin通路。CTNNB1基因和β-catenin蛋白在胰腺癌组织中均呈高表达，lincRNA-p21表达与β-catenin表达呈负相关，细胞内lincRNA-p21的表达变化同时影响细胞质及细胞核中β-catenin蛋白的表达，其对细胞核中β-catenin蛋白的表达影响更大。LincRNA-p21通过增强β-catenin蛋白Ser33/Ser37/Thr41位点的磷酸化修饰，从而介导其泛素化-蛋白酶体途径降解β-catenin，抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。