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目的:在5种人类疟原虫中,恶性疟原虫和间日疟原虫所致疟疾占95%以上,从而引发了严重的公共卫生问题。虽然恶性疟原虫的致死率最高,但是近年来有研究通过对恶性疟原虫和间日疟原虫致病率和致死率的评估发现两者在致病程度上高度一致,并且由于间日疟原虫特有的一些生物学特性和地理位置的分布,使其逐渐成为了人类消除疟疾的最大障碍之一,因此开发针对间日疟原虫的疫苗迫在眉睫。由于疟疾临床症状的出现是在红细胞内期,而裂殖子入侵红细胞对红内期寄生虫的发育又至关重要,所以开发针对裂殖子抗原的疫苗尤为重要。鉴于目前尚无间日疟原虫裂殖子转录组学和蛋白质组学的数据研究可供参考,本研究主要针对间日疟原虫成熟裂殖体蛋白进行筛选,通过小麦胚芽无细胞表达系统表达重组蛋白作为抗原与间日疟原虫患者的血清进行优势抗原的初步筛选,从而为后续的研究提供数据支持。研究方法:1)目的基因筛选。主要利用疟原虫数据库网站（http://www.plasmodb.org/）的组学数据和MATCH函数进行筛选。首先,利用Plasmo DB网站提供的转录组学数据筛选出成熟裂殖体基因。然后,利用MATCH函数筛选出共同表达在间日疟原虫、恶性疟原虫和伯氏疟原虫以及含有信号肽和（或）跨膜区的基因。最后,根据这些基因的转录水平及基因描述筛选出可成为红内期疫苗的候选抗原。2)开放阅读框（Open reading frame,ORF）的选择。在疟原虫数据库网站提供的相关数据基础上,进一步利用SMART网站预测目的基因蛋白结构域、TMHMM Server V.2.0网站预测其蛋白跨膜区、Immunomedicine Group网站预测其B细胞抗原表位,根据以上生物学信息分析选择合适的ORF。3)目的基因的获得。首先制备本次研究所需的扩增模板,包括基因组DNA（g DNA）和c DNA。以血液基因组DNA提取试剂盒提取本课题组保存的中缅边境的间日疟患者血液中的基因组DNA;提取相同患者血液中的总RNA并采用逆转录试剂盒反转录获得c DNA。然后,根据In-Fusion克隆技术要求设计针对ORF的特异性引物,即引物的5′端要有与载体末端完全同源的15个碱基,引物的3′端含有目的基因特异性序列。最后,分别以g DNA和c DNA作为模板,利用Prime STAR GXL DNA聚合酶、d NTP混合液、Nuclease free water和特异性引物通过PCR获取目的基因片段。4)蛋白表达载体的构建。应用In-Fusion克隆技术将目的片段与线性化p EU载体进行连接并转至DH5α感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定、质粒酶切鉴定及北京华大基因测序确定载体是否构建成功。5)重组蛋白的表达及鉴定。采用小麦胚芽无细胞表达系统（WGCFS）对成功构建的表达载体进行体外转录和体外翻译,从而获取重组蛋白进行Western Blot（WB）验证并通过ECL发光成像验证重组蛋白是否表达成功。6)重组蛋白与间日疟患者血清的免疫反应。首先,将间日疟原虫患者血液进行离心获取血清。然后,进行蛋白分离和湿转（过程与上述5）一致)。转膜结束后,分别用间日疟原虫患者血清（1:200）和兔抗人Ig G H&L（HRP）二抗（1:5000）与PVDF进行孵育。最后,通过化学发光仪进行成像分析。结果:1)成功筛选出492个目的基因。首先,根据Plasmo DB网站上提供的转录组学信息一共筛选出5180个表达在间日疟原虫的成熟裂殖体基因。然后,通过MATCH函数筛选出891个仅表达在成熟裂殖体且含有SP和（或）TMD的同源基因（P.v,P.b,P.f）。最后,根据转录水平与基因信息描述筛选出492个可能在膜表面表达的目的基因。2)成功获取102个目的片段。首先,利用生物信息学相关网站对100个目的基因进行分析,选择富含B细胞抗原表位和（或）结构域且排除SP和TMD后的氨基酸片段作为开放阅读框;然后,为了有效利用无细胞表达系统表达蛋白,每个ORF尽量不超过500个氨基酸,因此共选择了120个ORF并设计了120对特异性引物;最后,本研究成功获取了102个条带单一且清晰的目的片段（扩增效率为85%）。3)成功构建82个表达载体。通过菌落PCR和质粒酶切鉴定的方法筛选出91个质粒进行测序分析,经与标准序列比对共鉴定出82个表达载体构建成功（80.39%）。4)成功表达出67个重组蛋白。利用WGCFS对82个成功构建的表达载体进行蛋白表达,经WB验证和ECL发光成像后,正确表达的蛋白有67个（81.7%）。5)重组蛋白可与间日疟患者血清发生免疫反应。将成功表达的67个重组蛋白与间日疟患者血清进行免疫印迹反应,其中7个蛋白与患者血清出现了明显的免疫反应。结论:1)经生物信息学分析,本研究筛选出的492个目的基因均为保守的间日疟原虫成熟裂殖体蛋白,可作为红内期疫苗研究的潜在靶点。2)In-Fusion克隆技术和WGCFS可以有效表达间日疟原虫成熟裂殖体的重组蛋白。3)WGCFS表达的间日疟重组蛋白具有抗原性,可用于血清学反应的筛选。