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西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum_Schl.f.sp.cucumerirum)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)草莓炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers)是我国重要的植物病原真菌,由它们引起的植物病害可以对农业生产造成巨大的损失,产量与品质会大幅度降低。植物病害的误诊往往会造成防治决策的失误,加强病害的快速准确的诊断技术研究尤为必要。 本研究通过对五种病原真菌的特异性PCR扩增技术的研究,初步形成了各自的分子检测技术,主要结果如下: 1.对采集的典型的田间病样进行病原物的分离纯化,通过形态学形态学鉴定明确病原物的种类。通过对植物和真菌四种主要的基因组DNA的分离方法的比较,提出尿素法是植物病原真菌基因组DNA提取最优的方法。 2.采用通用引物ITS1和ITS4五种不同的病菌菌株的核糖体DNA转录l间区(ITS)进行了PCR扩增,获得了所有病原菌的ITS序列,其长度没有明显差异,在500-600bp之间。 3.不同病原菌ITS的PCR产物,通过克隆载体pGEM-T-Easy连接并转化后,进行测序,序列通过Nucleotide-nucleotide BLAST(blastn),在数据库中查找最相似的核苷酸序列。通过CloneManager、DNAClub等软件对所试菌种的ITS序列与相近种的病原真菌及相同寄主上其它病原真菌的序列比对和分析后,用Primer Premier 5.0软件设计了各种病原菌的特异性引物。 4.通过对近缘病原真菌及同一寄主植物其它病原菌基因组DNA的PCR扩增,检验所有设计引物的特异性,通过对病原菌特异性扩增条件进行优化,获得了五种不同的病原菌其特异性引物及其优化的PCR扩增条件。 西瓜蔓枯病菌(D.bryoniae):引物分别为XM-2 5′GCCTGCCATCTCT TACCCAT 3′和ITS4 5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′;扩增条件94℃ 3min 1个循环,94℃ 1min,60℃ 30s,72℃ 1min 30个循环;72℃ 20min。西瓜炭疽病菌(C. orbiculare):引物分别为XT-3 5′TCCCCCCCCGGGCC CGCTC 3′和ITS4 5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′;扩增条件94℃