牙釉质是哺乳动物体内最硬的组织，是上皮和间充质相互作用的产物。牙釉质特有的细胞外基质在羟基磷灰石晶体的形成和生长中起重要作用。成釉蛋白(ameloblastin，又称amelin，sheathlin)是由成釉细胞合成和分泌的细胞外釉基质蛋白，对大鼠的免疫组织化学研究表明它在分泌期和分泌后期成釉细胞中高度表达，成釉蛋白主要位于釉柱鞘中，认为成釉蛋白的作用可能为控制晶体的生长速度，维持晶体的生长，并决定釉柱的结构，但其作用的分子机理还不清楚。目前，已经克隆了大鼠、小鼠、牛、猪、人的成釉蛋白基因，有关成釉蛋白功能的研究正逐渐受到学者们的关注。本研究采用RT-PCR法从人牙胚组织总RNA中克隆人成釉蛋白基因，在原核和真核细胞中进行了成釉蛋白的表达，对原核表达的成釉蛋白C端肽进行了纯化，制备了抗人成釉蛋白抗体，标记了cDNA探针，对人牙胚组织进行了蛋白印迹(Western Blot)、免疫组化和原位杂交的研究，从mRNA水平和蛋白水平研究了人牙胚中成釉蛋白的表达特点，同时利用所获得的蛋白研究了成釉蛋白对人体外培养的牙髓细胞和牙周膜细胞的生物学效应，为今后进一步研究成釉蛋白的生理功能奠定了基础。本研究分为以下4个部分： 一、人成釉蛋白的基因克隆和序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从五月龄胎儿牙胚组织中抽提总RNA，用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA，然后利用PCR技术，设计一对引物从cDNA中扩增出中国人的成釉蛋白编码区基因片段(约1.3kb)，将扩增的基因片段插入pGEM-T Easy克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒DNA，通过限制性酶切进行鉴定并进行核苷酸序列测定。结果表明：克隆到人成釉蛋白编码区基因片段，序列与GenBank中收录的人成釉蛋白 第四军医大学博士学位论文．4． CDNA序列一致。 二、人成釉蛋白基因在原核和真核细胞中的表达 分别将克隆的人成釉蛋白编码区全长片段、编码成釉蛋白N端肽的 CDNA片段和编码成釉蛋白C端肽的CDNA片段连入表达载体pLCM182、 pGEX＊T4和pRSET－A中，转化大肠杆菌并诱导表达，在12％SDS－PAGE 凝胶上表达蛋白条带的相对分子量分别为 65 XIO’、46 XIO‘、52 XIO’，其中， 表达的成釉蛋白C端肽在宿主菌中是以可溶形式存在的，对其进行了大量诱 导并纯化获得了高纯度的成釉蛋白C端肽。以重组、纯化的成釉蛋白C端肽 为抗原，混入完全／不完全弗氏佐剂，免疫新西兰大白兔，将获得的多克隆抗 血清经硫酸胺初步纯化后，用 Western Blot检测人成釉蛋白的组织表达特异 性。Western Blot显示：成釉蛋白在人牙胚组织总蛋白中有特异性表达，在脑、 心、肝、脾、肺、肾、胰腺、胸腺、骨骼肌等组织中未见表达条带。 分别将人成釉蛋白基因克隆入非融合和融合真核表达载体pCDNA3＊和 PEGFP－C3中，证实克隆正确后，用脂质体介导将载体转染哺乳动物细胞 COS刁，通过免疫组织化学、Western Blot等方法检测成釉蛋白在哺乳动物细 胞中的表达。结果，表达的绿色荧光蛋白融合蛋白所发出的荧光位于细胞浆 中，胞核中无荧光，与免疫组化结果一致，说明人成釉蛋白位于细胞浆中。 WesternBlot检测显示在COSJ细胞中表达的成釉蛋白的分子量为 65X10＼ 分泌至培养基中的成釉蛋白的分子量为 62X 10＼ 三、人成釉蛋白的组织表达特性研究 用制备的抗人成釉蛋白抗体对人牙胚组织切片及狗牙周组织切片进行免 疫组化染色，发现成釉蛋白由内釉上皮细胞在分化为成熟成釉细胞前开始表 达，分泌期成釉细胞高度表达并持续整个釉质形成期，新形成的牙釉质染色 阳性；成牙本质细胞在分泌牙本质基质之前开始表达成釉蛋白，在牙本质形 成过程中成牙本质细胞持续表达成釉蛋白，呈弱阳性，前期牙本质中呈弱阳 性染色：上皮根鞘细胞染色阳性。狗牙周组织染色发现牙骨质表层细胞呈强 Dopar。ent ofoperatjVE厂enthay＆从J血加。in＝rFWU 第四军医大学博士学位论文－5－ 阳性染色，新形成的牙骨质中可见阳性染色颗粒，呈网状分布。将克隆的CDNA 片段双酶切后用地高辛标记法标记探针。对人牙胚组织石蜡切片的原位杂交 显示，成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞、部分牙髓细胞、上皮根鞘细胞 中有表达，表达部位与免疫组化结果一致。 四、表达纯化的人成釉蛋白对牙髓细胞和牙周膜细胞的生物学作用 为了解该蛋白在牙齿发育过程中的作用，采用四咬盐比色法和固相结合 分析实验观察了培养人牙周膜细胞和牙髓细胞在重组人成釉蛋白包被表面上 的附着和伸展情况，结果发现成釉蛋白能促进人牙周膜细胞的附着，不促进 其伸展，对人牙髓细胞的附着和伸展无促进作用。采用四哩盐比色法观察了 成釉蛋白对人牙周膜细?