论文部分内容阅读
结核病（Tuberculosis， TB）已经成为全世界传染病的头号杀手。据世界卫生组织(WHO)报道，全球有1/3的人感染了结核病，每年新增病人约900万人，每年死于结核病人数达到300万人[1]，其中死于结核病并且艾滋病毒（HIV）阴性者就高达110万，而死于TB联合HIV感染者高达35万[2]。更为严峻的是，中国每年有130万新发结核病患者，其中，耐多药结核菌感染者可达10万人[3]，是全球结核病的负担大国。TB的病原体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，MTB通过空气传播进入宿主的肺部，被巨噬细胞吞噬后，机体有可能依靠自身的免疫力快速消除MTB，但是如果免疫力低下就会发生活动性肺结核，最终难以消灭[4]。MTB是否能够成功存活于宿主细胞，取决于感染的菌量、分枝杆菌毒力以及宿主的免疫状态。所以，通过调节和维护胞内的信号机制以对抗MTB感染，宿主的免疫防御机制起到了十分的重要的作用[5]。MTB的感染机制不仅仅与巨噬细胞的存在密切关系[6-9]，而且和肺泡上皮细胞存在紧密的联系[10-14]。肺泡Ⅱ型上皮细胞（Alveolar epithelial cells typeⅡ，AECⅡ）是一组具有肺泡保护活性的细胞，同时也可合成和分泌表面活性剂和细胞因子[15]，在天然免疫过程中发挥重要的调节作用[16]。迄今为止，发现的MTB的毒力因子并不多，包括有ESAT6、CFP-10、Ag85、HBHA等。其中肝素结合血凝素黏附素（Heparin-binding hemag-glutinin adhesion，HBHA）是主要的结核分枝杆菌黏附素，在细菌黏附和侵袭肺泡上皮细胞过程中发挥着重要的作用。HBHA分子量为28kD，主要表达于MTB的表面，可结合肝素、硫化右旋糖苷等[17]。它有3个功能结构域，目前已经明确C端结构域可以介导MTB与宿主组织的硫化糖复合物黏附[18]，还可通过补体C3介导黏附于巨噬细胞和上皮细胞，在肺外播散型结核的发生中发挥重要功能。我们前期研究发现，结核分枝杆菌HBHA蛋白具有抑制AECⅡ自噬的作用，很可能籍此帮助MTB感染AECⅡ，并发生播散。为了进一步证明HBHA是否通过抑制细胞自噬而辅助了细菌感染，我们以与MTB同属的速生非致病性分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）作为载体，重组表达HBHA蛋白，验证了HBHA抑制自噬并促进感染的作用。一．重组耻垢分枝杆菌建立及验证1、构建重组耻垢分枝杆菌rMS-HBHA利用穿梭质粒pMV261，重组表达载体pMV261-HBHA电转化入耻垢分枝杆菌中，经PCR鉴定正确后，命名rMS-HBHA。将rMS-HBHA通过45°C诱导2hrs后，超声裂解菌体，经SDS-PAGE电泳可见，28kD处出现HBHA特定蛋白条带；Westernblot证实，目的蛋白条带能够结合抗HBHA多克隆抗体，证明HBHA在耻垢分枝杆菌中表达成功。2、重组耻垢分枝杆菌rMS-HBHA生长特性的观察用接种培养法将野生型MS与rMS-HBHA分别培养至对数期约OD600=0.6时，调整菌量至103个/mL，培养4、12、24、48、72、96、120、144hrs后检测菌OD600值，并绘制生长曲线。结果显示，与MS相比，rMS-HBHA生长速率无明显变化。3、rMS-HBHA与A549细胞的相互作用3.1感染A549细胞中细菌的活菌数：分别将rMS-HBHA和MS以10:1（细菌：细胞）的MOI感染A549细胞。分别于1、10、18hrs后，加入庆大霉素100μg/ml作用1hrs来杀死细胞外残留的活细菌，涂于7H10（OADC）固体培养皿上，培养3-4d，分别计数A549细胞感染MS和rMS-HBHA后的胞内活菌数（CFU）。结果表明， rMS-HBHA组胞内活菌数为6.3×106，明显高于MS组1×105，差异有统计学意义（P<0.05）。3.2检测rMS-HBHA和MS感染A549细胞的细胞毒性：设计实验分为三组：实验组（rMS-HBHA+A549）、对照组（MS+A549）、无感染A549组，将MS和rMS-HBHA感染A549细胞，于不同的时间点（4、6、10、14、18hrs）收集上清培养液，测量OD490吸光值并绘制柱状图。结果表明，rMS-HBHA组细胞毒性(68%)远高于MS组(40%)，P<0.05。二、rMS-HBHA感染肺泡Ⅱ型上皮细胞后自噬作用的观察以MS和rMS-HBHA分别感染A549细胞18hrs，Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达情况，并检测LC3-Ⅱ/LC3Ⅱ比值的变化；利用单丹磺酰尸胺（MDC）将自噬体染色后，激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况。相对野生型耻垢分枝杆菌(MS)，重组表达HBHA蛋白的耻垢分支杆菌(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅱ和LC3Ⅱ的表达，rMS-HBHA组的LC3-Ⅱ/LC3Ⅱ比值（0.625）显著低于MS组（2.025），表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制。细胞经MDC染色后，激光共聚焦发现rMS-HBHA感染的细胞自噬体成熟度显著降低。以上实验初步证明，HBHA具有增强MS感染与播散的作用。