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凝集素(Lectins)是一类非免疫原性、具有糖结合专一性、能凝集细胞和(或)沉淀含糖高分子的蛋白质或糖蛋白。广泛存在于植物、动物和微生物中。本实验以成熟洋刀豆(Canavalia ensiformis (L.)DC)干豆粒为原料,提取、分离纯化刀豆凝集素(Concanavalin A,简称ConA),并对其性质进行了初步的探索研究。血凝法适宜于凝集素的含量检测,具有操作简便,反应迅速,效果明显,受条件影响较小等优点。实验采用浓度为1.75 U/mL的胰蛋白酶修饰人血红细胞来检测洋刀豆干豆粒中ConA的含量,可使其血凝活力测定值提高三个数量级(8倍),增加了血红细胞的敏感性以及凝集素活力检测的灵敏度。样品的检测参数为:洋刀豆干豆粒粉碎过60目筛、脱脂剂选用30 ~ 60℃沸程的石油醚,脱脂剂与原料的料液比(W/V)为1:8,脱脂时间8 h,样品浸提液选用pH 7.4, 0.01 mol/L的PBS缓冲液。本课题对ConA的提取工艺条件进行了优化研究。根据单因素实验结果设计了三因素三水平的响应面分析实验,得到ConA的提取优化工艺参数为:提取液料比(V/W)为8.88:1,提取时间8.65 h,PBS提取液中含NaCl的离子强度为0.17 mol/L,离心转速为10000 g。最佳工艺条件下提取,得到的ConA比活力为167.61 HU/mg。选择70%饱和度的固体(NH4)2SO4进行分级盐析,ConA比活力提高至237.43 HU/mg。采用DEAE-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析进一步分离纯化刀豆凝集素粗提物,得到ConA纯品,纯品在SDS-PAGE凝胶电泳上显示单一的蛋白谱带,测定ConA的亚基分子量为29 600 Da,与Sigma公司的ConA标准品迁移率相同,其总活力回收率为57.06%,比活力较洋刀豆浸提液的初始活力提高了50.15倍,并与Sigma公司的ConA标准品进行了血凝活力的对比测定,两者血凝活力接近,仅相差一个数量级,这说明了本实验所采用的分离纯化方法是可行的。实验针对ConA的性质研究表明:ConA是一种对热较稳定的凝集素,60℃以下时ConA很稳定,100℃保温20 min后,血凝活力完全丧失。在pH值范围5.8 ~ 8.3时,ConA的血凝活力较高,当pH >11.9时,血凝活力完全丧失。D-葡萄糖和D-甘露糖是ConA的专一性结合糖。ConA对人的A、B、O、AB四种血型及供血动物(兔,鸡,鸭,鸽,鲤鱼,鲫鱼)的血红细胞均能发生凝集作用,无血型专一性和供体细胞专一性;ConA的血凝活力依赖于Ca2+和Mn2+存在,用EDTA络合ConA中的金属离子,发现ConA的血凝活力丧失,并且这种反应也是可逆的,可通过补充Ca2+和Mn2+,使ConA的血凝活力恢复。氨基酸组成分析表明,除色氨酸(Trp)因水解破坏未被测出外,ConA可测出17种水解氨基酸,其中富含天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)等酸性氨基酸。紫外吸收光谱是凝集素的特征光谱之一,ConA在220 nm到340 nm之间有一个紫外吸收峰,最大峰值在276 nm左右。实验利用内源荧光方法研究了ConA在不同条件下的溶液构象变化和Trp残基微环境的构象特征。研究表明,ConA在天然状态下,激发波长为280 nm和295 nm时,其荧光发射光谱均呈现最大荧光发射峰334 nm。和游离Trp最大荧光强度的波长348 nm相比,蓝移了14 nm,表明Trp残基位于ConA较为疏水区域。pH和变性剂脲都能使ConA的荧光强度降低,但荧光光谱的形状和荧光发射峰的位置没有明显的变化,这说明ConA的结构比较稳定。