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蛋白质分泌系统是细菌生长和生存所必需的。于2005年发现的Ⅸ型分泌系统（T9SS）被证明仅在拟杆菌门中广泛存在,并参与大量重要蛋白的分泌。T9SS底物蛋白的共同特征是都具有N端信号肽和保守的C端结构域（C-terminal domain,CTD）。在N端信号肽的引导下T9SS底物蛋白通过Sec系统进入周质空间,再在CTD的协助下底物蛋白经T9SS转运至细胞表面或者细胞外。CTD作为T9SS的识别转运信号,在底物蛋白的分泌和外膜锚定中发挥重要作用。然而,T9SS识别底物蛋白CTD的机制尚不清楚。纤维素降解机制独特且新异的革兰氏阴性好氧细菌Cytophaga hutchinsonii广泛分布于土壤中。作为拟杆菌门的成员C hutchinsonii具有编码T9SS组分蛋白的所有同源基因。生物信息学分析显示C.hutchinsonii中至少有147个蛋白由T9SS加工分泌。CHU3220已被证明经T9SS分泌到细胞表面并参与结晶纤维素的降解。本文根据T9SS底物蛋白的特征,将T9SS底物蛋白的N端信号肽与CTD融合报告蛋白GFP在C.hutchinsonii中表达以探究T9SS识别底物蛋白CTD的机制。未知功能蛋白CHU2708是C.hutchinsonii中唯一具有明确CTD切割位点T9SS底物蛋白,当GFP融合CHU2708的信号肽与CTD表达时,我们利用anti-GFP抗体在该表达菌株的周质组分中意外发现一个比GFP-CTDCHU2708多肽序列分子量大约5 kDa的GFP相关蛋白（约40 kDa）。纯化的周质GFP相关蛋白经质谱鉴定、糖染色以及凝集素亲和实验证明40kDa处的GFP相关蛋白是糖基化修饰蛋白,因此将它命名为糖基化的GFP。进一步研究发现糖基化的GFP能被去除N-连接聚糖的PNGase F酶酶切,表明它是N-糖基化修饰蛋白。对CTDCHU2708序列中符合典型N-糖基化修饰基序N-X-S/T（X≠P）的天冬酰胺位点进行突变,我们发现CTDCHU2708的N296位点被突变时周质空间中糖基化的GFP明显减少,且GFP相关蛋白的分泌和定位缺陷,表明CTDCHU2708的N-糖基化修饰在T9SS识别和转运底物蛋白过程中发挥作用。当GFP融合T9SS底物蛋白纤维素酶CHU1336的CTD在C.hutchinsonii中表达时,我们利用anti-GFP抗体在周质组分中也检测到一个分子量接近40 kDa的蛋白条带。此蛋白能被ConA凝集素亲和,且能被PNGase F酶酶切。定点突变实验发现CTDCHU1336中N900位点突变后,周质中糖基化的GFP重组蛋白完全消失,表明N900是CTDCHU1336的N糖基化修饰位点。此外,CTDCHU1336N-糖基化修饰位点附近的氨基酸D898或S902被突变时也影响周质中糖基化的GFP重组蛋白,表明C.hutchinsonii中CTDCHU1336的N-糖基化修饰基序为D-X-N-X-S,符合Campylobacter jejuni中保守的N-糖基化修饰基序D/E-X-N-X-S/T（X≠P）。C.hutchinsonii中糖基转移酶CHU3842与C.jejuni中参与蛋白N-糖基化修饰的PglA之间有28%的氨基酸序列相似性。敲除chu3842后,突变株周质中N-糖基化修饰的蛋白含量明显降低。此外,在Δ3842突变株中CTDCHU2708与CTDCHU1336的N-糖基化修饰均受到影响,表明chu3842是参与C.hutchinsonii中蛋白N-糖基化修饰的重要基因。chu3842的敲除还影响C.hutchinsonii纤维素降解能力、细胞运动能力以及对多种化学试剂的抗逆性。糖基转移酶相关蛋白CHU0012具有与合成复杂聚糖底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖结合的保守结构域。敲除chu0012不仅影响T9SS底物蛋白CTD的N-糖基化修饰,还影响T9SS底物蛋白的分泌和外膜锚定。凝集素亲和实验发现Δ0012突变株周质中糖基化修饰蛋白含量降低。此外,chu0012的敲除还影响了 C.hutchinsonii的纤维素降解能力以及外膜蛋白的丰度。以上实验结果表明拟杆菌门成员C.hutchinsonii具有参与纤维素降解等重要生理功能的N-糖基化修饰系统,也表明细菌的N-糖基化修饰系统并非局限于变形菌门和弯曲杆菌门。T9SS底物蛋白纤维素酶CHU1107的CTD序列中无符合N-X-S/T的N-糖基化修饰基序。当CTDCHU1107融合GFP在C.hutchinsonii中表达时,anti-GFP抗体在周质组分中检测到一个分子量接近40 kDa的蛋白条带。经鉴定此蛋白为糖基化修饰蛋白,并且能被去除O-连接聚糖的糖苷酶酶切,表明CTDCHU1107存在O-糖基化修饰。结合前期我们发现的N-糖基化修饰的CTDCHU2708与CTDCHU1336,表明T9SS底物蛋白CTD修饰的多样性。CHU0890是B.fragilis中参与蛋白O-糖基化修饰BF4305的同源蛋白,两者的序列相似性为29%。CHU0895是CHU0890附近的糖基转移酶相关蛋白。chu0890和chu0895的敲除影响了 O-糖基化修饰的GFP融合蛋白在C.hutchinsonii周质中的积累以及纤维素降解能力。此外,敲除chu0895还影响了 C.hutchinsonii细胞的运动能力。这些实验结果表明O-糖基化修饰系统参与C.hutchinsonii中一些重要的生理功能。将纤维素酶CHU1655或者CHU1075的CTD融合GFP表达时,我们利用anti-GFP抗体在表达菌株周质组分中未发现分子量增加的GFP相关蛋白,表明CTDCHU1655与CTDCHU1075未发生糖基化修饰。我们以CTDCHU1655与CTDCHU1075为T9SS识别元件构建了报告蛋白为LacZ的细胞表面展示系统,并在细胞表面检测到LacZ酶活,证实C.hutchinsonii T9SS具有细胞表面蛋白展示系统的潜质。我们的研究首次发现T9SS的识别信号CTD在C.hutchinsonii的周质中存在N-糖基化修饰与O-糖基化修饰现象,同时也表明了 T9SS底物蛋白CTD修饰的多样性。在C.hutchinsonii中,T9SS识别信号CTD的N-糖基化修饰影响底物蛋白的分泌和定位。此外,N-糖基化修饰系统还与C.hutchinsonii的纤维素降解能力、细胞运动能力以及抗逆性等多种表型密切相关。这些发现为揭示T9SS识别底物蛋白CTD的机制以及C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制提供了新角度。我们的研究结果不仅将细菌N-糖基化修饰系统拓展到拟杆菌门,也丰富了对细菌N-糖基化修饰系统生理功能的认识。