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背景与目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的高感染率及其严重的危害性,使Hp疫苗成为当今研究的热点之一。随着疫苗研究的深入,应用混合抗原成分制备Hp疫苗将是未来Hp疫苗研究的趋势。细胞内感染性细菌减毒后作为DNA疫苗载体是目前基因疫苗研究的热点之一。沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种较为常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低,但仍保留良好的侵袭力,可直接将表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白而诱导特异性的免疫应答反应。但由于其质粒中含有抗生素抗性基因,尽管其在体外试验有效,在人体内却无法应用,Nakayama等构建的平衡致死系统解决了这一问题。本课题拟构建幽门螺杆菌BabA2/UreI融合基因双价DNA疫苗,首先通过基因工程技术构建含asd基因的重组原核表达质粒,并利用沙门氏菌asd平衡致死系统,最终获得表达重组人BabA2/UreI融合基因蛋白的重组沙门菌减毒疫苗株x8501(pYA3342/BabA2/UreI),并检测目的蛋白的表达和抗原性,为制备预防Hp感染的DNA疫苗奠定基础。方法:①BabA2/UreI融合基因的克隆:以pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI融合基因重组真核表达质粒为模板PCR扩增BabA2/UreI融合基因,PCR产物连接到pCF-T载体上,用TSS法转化到大肠杆菌DH5α,用氨苄青霉素和蓝白筛选法挑选T-A克隆,并测序。扩增含有BabA2/UreI融合基因的大肠杆菌DH5α,提取质粒,用SmaI和SalI酶切质粒,获得高浓度的融合基因。②构建原核表达载体:SmaI和SalI双酶切asd的组成型表达的原核表达载体pYA3342,将编码BabA2/UreI的融合基因插入pYA3342,构建pYA3342/BabA2/UreI重组质粒;TSS法转化入大肠杆菌x6212,筛选重组子;测序和酶切鉴定。③转化减毒伤寒沙门氏菌x8501株构建活载体疫苗株:采用缺失天门冬氨酸-β-半醛脱氢酶(△asd)的伤寒沙门氏菌x8501作为载体菌,将pYA3342/BabA2/UreI重组质粒电转化入减毒伤寒沙门氏菌x8501,构建表达BabA2/UreI融合基因平衡致死的减毒伤寒沙门重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI),提取质粒,酶切和PCR扩增鉴定。④目的基因mRNA测定:RT-PCR检测x8501(pYA3342/BabA2/UreI)mRNA的表达。⑤重组蛋白抗原性检测:分别提取培养上清和细菌蛋白,SDS-PAGE分离重组蛋白,以兔抗Hp的多克隆抗体为一抗,用Western Blot法检测重组蛋白的抗原性。⑥重组疫苗稳定性检测:重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)在体外连续培养5天后,提取质粒,检测稳定性。结果:①利用PCR技术从pcDNA3.1(-)/BabA2/UreI中扩增出了BabA2/UreI融合基因,琼脂糖凝胶电泳证实大小与预计一致,并成功构建了BabA2/UreI的重组质粒pCF-T/BabA2/UreI。测序结果证实BabA2/UreI融合基因正确插入到pCF-T载体中。②成功构建了pYA3342/BabA2/UreI重组质粒,测序分析显示所得序列完整,插入的基因片段全长2860bp,与基因文库中的BabA2和UreI基因的同源性分别达100%和97%。③成功构建了表达BabA2/UreI的减毒伤寒沙门菌重组菌株x8501(pYA3342/BabA2/UreI);酶切和PCR扩增鉴定证实重组质粒成功转入x8501。④RT-PCR结果显示融合基因能有效转录。⑤免疫印迹显示减毒伤寒沙门重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI)可以表达融合蛋白BabA2/UreI,并能够被兔抗Hp的多克隆抗体识别,分子量大约是106KDa,并可以呈现分泌性表达。⑥重组质粒能稳定存在于宿主菌,并无丢失。结论:①成功构建pYA3342/BabA2/UreI重组质粒;②成功构建了减毒伤寒沙门氏重组菌x8501(pYA3342/BabA2/UreI),融合基因能有效转录,融合蛋白能够被兔抗Hp的多克隆抗体识别,重组质粒能稳定存在于宿主菌;③本研究为开发可能应用于人类的抗Hp疫苗提供重要的靶抗原和载运系统选择依据,并为进一步进行蛋白质功能鉴定和动物试验研究奠定了基础。