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目的:采用Pulsinelli四血管阻断法建立大鼠全脑缺血-再灌注损伤模型,比较全身降温和鼻咽腔降温对降低海马温度速度的影响,通过观察缺血及再灌注期间海马CA1区细胞外液谷氨酸(Glutamic acid,Glu)浓度([Glu]e)的变化,以及相关凋亡基因的表达,探讨鼻咽腔降温法对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:1实验分组及动物模型制备健康雄性Wistar大鼠18只,体重250±20g(河北医科大学实验动物中心提供)。随机分为3组(每组6只),常温组(A组),全身降温组(B组)和鼻咽腔降温组(C组)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后将动物俯卧位固定于实验台上,于颈后正中第一、二颈椎处切开皮肤,剥离显露双侧翼小孔,烧灼两侧的椎动脉使其闭塞, 24h后再用同法麻醉动物,气管插管吸氧自主呼吸。股静脉切开置管以1ml/h的速度输入乳酸钠林格氏液。作颈前正中切开皮肤,分离出双侧颈总动脉,用4-0丝线穿过颈总动脉备用,部分缝合颈部伤口。动物立体固定后,头皮刺入电极,持续监测脑电图(EEG),四肢皮下刺入电极,持续监测心电图(ECG)。切开头皮,用微型颅钻分别在左右海马CA1区(前囟[bregma]3.6mm和中线左、右旁开3mm)打开一直径约2mm的圆孔,将微透析探针刺入左侧海马CA1区2mm,用乳酸钠林格氏液以2.5μl/min的速度持续灌注,稳定60min待脑电图波形稳定后收集脑组织透析液,间隔时间为10min,直至再灌注后2h。右侧海马CA1区置入微型温度探头监测海马温度。室温保持在25℃。之后按照实验分组给予不同的处理。常温组(A组):整个实验过程中保持大鼠直肠和海马温度均为37±0.5℃,用动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min。全身降温组(B组):应用电扇、冰袋和酒精等使海马温度降至33℃后再夹闭双侧颈总动脉20min。鼻咽腔降温组(C组):将气管插管的大鼠咽喉下部置一棉团和吸引设备避免误吸。两侧鼻腔插入自制硅胶管,深度5mm,持续注入5℃生理盐水,速度为100ml·min-1·kg-1 ,直至海马温度降至靶温度33℃,夹闭双侧颈总动脉20min。B、C两组低温维持1h后应用变温毯和白炽灯复温至37.0±0.5℃。以上各组均同时监测直肠温度并维持在37±0.5℃。2标本的采集及检测方法2.1微透析液的收集及测定微透析液收集后保存在-70℃。利用高效毛细管电泳法测定出各种浓度的谷氨酸标准品的峰面积,并绘制标准曲线、求得回归方程。利用该方法测出每个样品中谷氨酸的峰面积,根据回归方程求得谷氨酸的浓度。2.2 Bcl-2、Bax表达的检测大鼠脑缺血再灌注8h后深麻醉沿肋缘剪开胸廓暴露升主动脉和心脏,提起心尖剪开左心室,插灌注针至升主动脉并固定,接灌流固定液(50ml肝素盐水及50ml4%多聚甲醛)同时剪开右心耳并推注固定液将全身固定。固定完毕后断头,剥开颅骨取出全脑,取海马所在的节段区放入4%多聚甲醛溶液中固定。Bcl-2、Bax免疫组化测定采用SP法,按照试剂盒的要求步骤依次进行。结果:1各组间大鼠的体重比较无统计学差异。2降温速度比较B组海马温度从37℃降到33℃所需时间为31±2.7min,而C组为6.5±0.7min,前者是后者的4.8倍。3缺血前各组间海马CA1区[Glu]e比较无统计学差异(P>0.05)。4缺血中各组间海马CA1区[Glu]e比较缺血10min和20min时,与A组比较,B组、C组[Glu]e明显降低(P<0.05);B组、C组两组之间比较无统计学差异(P>0.05)。5再灌注后10min、20min、30min时, B组、C组[Glu]e比A组明显降低(P<0.05);B组、C组之间比较无统计学差异(P>0.05)。其余时间点两两比较无统计学差异。6各组内海马CA1区[Glu]e恢复至缺血前水平的时间: A组、B组、C组海马CA1区[Glu]e恢复至缺血前水平所需时间分别为40min、20min、20min。7各组海马CA1区Bax表达的比较与A组比较,B组与C组的Bax免疫阳性细胞数及灰度值显著减少减小(p<0.05),B组与C组比较无统计学差异。8各组海马CA1区Bcl-2表达的比较与A组比较,B组与C组的Bcl-2免疫阳性细胞数及灰度值显著增多增大(p<0.05),B组与C组比较无统计学差异。结论:1鼻咽腔降温与全身降温同样具有脑保护作用,均能抑制缺血再灌注时脑细胞外谷氨酸的升高,减弱Bax的表达,增强Bcl-2的表达。2鼻咽腔降温法降低海马温度的速度明显快于全身降法,前者约为后者的5倍。