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抗菌肽作为生物免疫系统的主要组成部分,是生物体的免疫作用产生的抗菌谱广、难以产生耐药性的一类带正电荷的两亲性小分子多肽。目前在医药、食品及畜牧业领域应用广泛。将两种或多种抗菌肽片段杂合形成一种新型的杂合肽,能够弥补天然抗菌肽的缺点,增加抗菌肽的抑菌活性。本研究将蛙皮素抗菌肽与死亡素抗菌肽的有效作用部位拼接,获得新型的杂合肽MT。根据杂合抗菌肽MT基因与大肠杆菌密码子的偏好性设计了该杂合肽的基因序列,对该基因进行生物信息学分析;利用SOE-PCR技术设计了三段引物,经过两轮PCR扩增获得目的基因MT,将目的基因克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1构建重组表达载体pGEX-6P-1-MT;将构建的重组表达载体转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)中构建了基因工程菌pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3),通过对IPTG浓度、诱导时间、温度以及培养基等发酵条件的优化,利用GST琼脂糖凝胶层析柱对融合蛋白进行纯化,肠激酶裂解后对杂合抗菌肽的抑菌活性进行初步分析。本论文研究结果如下:(1)生物信息学手段对杂合抗菌肽MT的理化参数、二级结构、亲水性等进行预测得出:氨基酸总数为29,分子量大小为3.35 kDa,等电点pI为10.57,含有α螺旋与β折叠结构,亲水性图谱结果显示该杂合肽具有两亲性,具有抗菌潜力。根据大肠杆菌密码子偏好性,优化了该基因序列,最终得到具有抗菌潜力的目的基因MT序列。(2)利用重叠延伸扩增(SOE-PCR)技术,用合成的三段引物通过两轮PCR成功合成了杂合抗菌肽MT的基因。(3)目的基因MT与表达载体p GEX-6P-1用EcoR I和BamH I双酶切,然后进行重组载体的构建,成功获得了重组表达载体pGEX-6P-1-MT。(4)超声破碎细胞进行SDS-PAGE电泳发现,融合蛋白以可溶形式存在于菌体上清,Western-blot证明目的蛋白表达,用GST琼脂糖凝胶纯化柱对杂合肽纯化,纯化后获得融合蛋白,占菌体总量的50.1%,蛋白的表达量为49.5 mg/L,肠激酶切割后得到分子量为3.35 kDa大小的MT目的蛋白。(5)通过对杂合抗菌肽MT工程菌诱导表达条件的优化,获得了杂合抗菌肽MT工程菌的优化后条件分别为:IPTG浓度0.8 mM;诱导时间3 h;诱导温度37℃;TB培养基。(6)采用抑菌圈法对杂合抗菌肽MT的抑菌活性进行研究,发现该杂合肽对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用,抑菌圈大小分别为5 mm、6 mm和10 mm,对枯草芽孢杆菌的抑制效果强于前两者。最小抑菌浓度分别20μM、16.5μM、9μM。本研究成功实现了杂合肽MT在大肠杆菌pGEX-6P-1表达载体中的可溶性表达,通过纯化获得了纯度较高、具有抗菌活性的MT目的蛋白,在食品、医疗、饲料领域等有一定的应用价值。