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脓毒症是由于宿主对病原体感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。脓毒症性休克和脓毒症ARDS作为最严重的临床表现形式,常伴有严重低血压,微血管灌注不足和组织缺氧,最终导致多器官功能衰竭。由于脓毒症发生机制尚未完全明确,脓毒症仍局限于液体复苏和对症支持等治疗,多年来死亡率一直居高不下。血管内皮功能障碍是脓毒症发生的主要因素。脓毒症发生时,血管内皮一旦被激活,其迅速变为促凝,抗纤维化和促粘附的状态。脓毒症时血管内皮激活与微循环血流变化,血管通透性改变,白细胞聚集及炎症反应相关。因此,血管内皮在脓毒症发生中扮演重要角色,可以作为脓毒症治疗的潜在靶点。近年来,核内不均一性核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1,hn RNP A2/B1)的研究受到广泛关注。作为核内不均一性核糖核蛋白家族的分子,hn RNPA2/B1在m RNA剪接,核-胞质转运,转录后调控,染色体稳定性调控等方面发挥重要作用。同时,hn RNP A2/B1可调节细胞生物学功能,如调节细胞代谢,迁移和侵袭,增殖和线粒体应激等。研究发现hn RNP A2/B1可通过调节CDKs抑制因子p16INK4a、P21、P27的转录水平,参与对细胞周期的调控。最近,有研究发现hn RNP A2/B1通过调节E-cadherin表达参与肺癌上皮细胞间充质转化。同时,在胰腺肿瘤组织中,hn RNP A2/B1的蛋白表达水平与E-cadherin表达缺失呈正相关。但hn RNP A2/B1在脓毒症血管内皮损伤中是否发挥作用尚未见报道。本研究主要通过LPS刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)构建脓毒症血管内皮损伤的模型,探寻hn RNP A2/B1在脓毒症所致血管内皮损伤中发挥的作用及其可能机制。首先,研究hn RNP A2/B1在LPS刺激时对血管内皮细胞功能的影响;然后在明确hn RNP A2/B1对血管内皮发挥保护作用的基础上,进一步探讨hn RNP A2/B1发挥血管内皮保护功能的可能机制。第一部分hn RNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的影响目的研究hn RNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法利用si RNA转染技术沉默hn RNP A2/B1,研究在LPS诱导的HUVECs损伤时沉默hn RNP A2/B1对内皮功能的影响。实验分为四组:(1)hn RNP A2/B1 si RNA组(2)Negative control(NC)si RNA组(3)hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组(4)NC si RNA-LPS组,经处理后利用内皮细胞跨膜电阻抗(TEER)和FITC-葡聚糖通透实验研究内皮细胞通透性改变,利用划痕和Transwell迁移实验研究内皮细胞迁移功能改变,利用Western blot方法检测内皮细胞相关粘附分子的表达改变。结果1、利用si RNA转染HUVEC后,RT-PCR和Western blot显示hn RNP A2/B1si RNA-664组hn RNP A2/B1的m RNA和蛋白表达水平均明显低于NC-si RNA组,差异有统计学意义(P<0.05)。2、LPS刺激HUVEC 12h后,NC si RNA-LPS组TEER值较NC si RNA组明显下降,hn RNPA2/B1 si RNA-LPS组TEER值较NC si RNA-LPS组进一步降低(P<0.05)。同时,NC si RNA-LPS组FITC-葡聚糖的荧光强度高于NC si RNA组,hn RNPA2/B1 si RNA-LPS组FITC-葡聚糖的荧光强度较NC si RNA-LPS组明显升高(P<0.05)。3、划痕实验中,hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组细胞迁移距离较NC si RNA-LPS组明显降低(P<0.05),Transwell迁移实验中,hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组细胞迁移数量较NC si RNA-LPS组明显减少(P<0.05)。4、LPS处理后,NC si RNA-LPS组VE-Cadherin蛋白表达较NC si RNA组减少,hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组VE-Cadherin表达较NC si RNA-LPS组明显下调(P<0.05);同时,NC si RNA-LPS组ICAM-1蛋白表达较NC si RNA组增加,hn RNP A2/B1si RNA-LPS组ICAM-1表达较NC si RNA-LPS组明显上调(P<0.05)。结论在LPS刺激HUVECs诱导的血管内皮损伤中,沉默hn RNP A2/B1明显增加血管内皮通透性,阻碍血管内皮相关的细胞迁移能力,上调细胞间粘附分子ICAM-1和抑制血管内皮钙黏蛋白VE-Cadherin产生,加重血管内皮屏障功能的破坏。提示:hn RNP A2/B1在脓毒症诱导的血管内皮损伤中发挥保护作用,其表达可能有助于减轻血管屏障的损伤程度。第二部分hn RNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤保护作用的可能机制目的研究hn RNP A2/B1对LPS诱导的血管内皮细胞损伤产生保护作用的可能机制。方法实验分为四组:(1)hn RNP A2/B1 si RNA组、(2)Negative control(NC)si RNA组、(3)hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组、(4)NC si RNA-LPS组,在LPS处理HUVEC 12h后,利用Western blot方法检测不同实验组中β-catenin、Src、Cdc42等信号分子的表达改变。结果hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组β-catenin表达低于NC si RNA-LPS组(P<0.05);与NC si RNA-LPS组相比,hn RNP A2/B1 si RNA-LPS组的Src分子磷酸化表达水平上调(P<0.05),而Cdc42分子磷酸化表达水平无明显差异。结论hn RNP A2/B1可能通过上调β-catenin表达及抑制Src磷酸化发挥内皮保护作用,从而保护脓毒症肺损伤时血管内皮屏障的相关功能。