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目的探究癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)后血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)通透性变化的时间模式以及髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)对BBB和自发性复发性癫痫(Spontaneous recurrent seizures,SRS)的影响。方法第一部分:选取雄性C57BL/6小鼠50只,随机分为癫痫组(n=45)和假诱导组(n=5),其中癫痫组经腹腔注射匹罗卡品诱导SE后,根据观察时间节点的不同分为:0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和30 d六组;假诱导组腹腔注射同等剂量的生理盐水作为对照。采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量。血清中S100β蛋白含量和脑组织中白蛋白含量用于评估BBB的通透性,根据小鼠SE后不同时间节点蛋白含量的变化探究BBB通透性变化的时间模式。第二部分:选取雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为4-氨基苯甲酰肼(4-aminobenzoic hydrazide,ABAH)组(n=15)、生理盐水组(n=15)和假诱导组(n=10)。ABAH组小鼠腹腔注射匹罗卡品诱导SE后2小时腹腔注射MPO特异性抑制剂ABAH(40mg/kg),以后2次/日给药;生理盐水组在诱导SE后2小时腹腔注射同等剂量的生理盐水;假诱导组未使用匹罗卡品诱导SE的发生,余处理同生理盐水组。成功诱导SE 24小时后,选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,采用水合氯醛麻醉后摘眼球取血法收集血清标本;采用心脏灌注后断头取脑法收集脑组织标本;采用酶联免疫法检测血清中S100β蛋白含量;采用免疫组化法检测脑组织中白蛋白的含量,评估ABAH对BBB通透性的影响。选取诱导成功的生理盐水组、ABAH组和假诱导组小鼠各五只,每日给药前1小时观察并记录小鼠癫痫首次发作的时间、每日发作的频率,评估MPO对癫痫复发的影响。结果1.小鼠在腹腔注射匹罗卡品4.5±2.2min后即出现面部无意识运动、尾部僵硬、冷汗淋漓以及全身震颤等癫痫1-2级发作;20.4±8.2min后出现癫痫3级及以上发作,如双侧前肢的肌阵挛、后肢站立以及姿势失控、跳跃、跌倒等表现。本实验用于诱导SE的小鼠共计75只,其中25只小鼠抽搐剧烈死亡,成功诱导SE小鼠50只,诱导成功率为66.7%。假诱导组小鼠在整个实验过程中无任何癫痫样发作。2.SE后,在不同时间节点测定小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组相比,SE后0小时癫痫小鼠血清中S100β蛋白含量即有明显升高(P=0.0022)。在SE后6 h、12 h、24 h小鼠血清中S100β蛋白含量均较假诱导组明显升高(P<0.001)。此后小鼠血清中S100β蛋白含量有下降趋势,SE后48h小鼠血清中S100β蛋白虽然较假诱导组有显著升高(P=0.0085),但是较SE后24 h已有明显降低(P=0.0156)。SE后30 d,小鼠血清中S100β蛋白含量仍较假诱导组明显升高(P=0.0018)。3.SE后,在不同时间节点取小鼠的脑组织标本,行免疫组化染色示:在SE后0 h,小鼠颞叶和海马组织内即有阳性表达的白蛋白,散在分布于细胞内和细胞外。SE后6 h、12 h和24 h,小鼠颞叶和海马组织内白蛋白的表达量明显升高且呈上升趋势。至SE后48 h,小鼠脑组织内白蛋白的表达较前有所减少,呈下降趋势。4.SE后24 h,测定假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组比较,生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量明显升高(P=0.0004);ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量也显著升高(P=0.0072);生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量较ABAH组明显升高(P=0.0182)。5.SE后24 h,取假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠的脑组织标本,行免疫组化染色示:在颞叶周围的血管内,均存在大量阳性表达的白蛋白颗粒,沿血管走形方向分布。其中,在假诱导组中,阳性表达的白蛋白局限在血管内,血管周围的颞叶组织只有极少量存在。而在生理盐水组中,虽然阳性表达的白蛋白主要存在于血管内,但是血管周围的颞叶组织内亦有大量存在。在ABAH组中,阳性表达的白蛋白主要分布在血管内,但血管周围的颞叶组织内也存在少量阳性表达的白蛋白颗粒。在海马组织中,生理盐水组白蛋白的表达量明显比假诱导组和ABAH组高。6.在后续的行为学观察中,生理盐水组和ABAH组所有成功诱导SE的小鼠均出现SRS。与生理盐水组比较,ABAH组SRS发生的时间延迟(180.8±3.544h vs 146.8±2.973h,P=0.0001),癫痫发作的频率降低(0.176±0.007/h vs0.34±0.018/h,P<0.0001)。7.SE后30 d,测定假诱导组、生理盐水组和ABAH组小鼠血清中S100β蛋白含量发现:与假诱导组比较,生理盐水组小鼠血清中S100β蛋白含量明显升高(P=0.0018);ABAH组S100β蛋白含量未见明显升高(P=0.2819)。生理盐水组S100β蛋白含量较ABAH组明显升高(P=0.0187)。结论1.经腹腔注射匹罗卡品诱导SE后,BBB通透性的变化具有时间模式,至24 h BBB通透性的变化最为明显,可以作为SE发生后评估BBB通透性的重要时间节点。2.MPO特异性抑制剂ABAH可以降低BBB的通透性,同时延迟癫痫的复发时间,降低癫痫发作的频率,对癫痫发作具有治疗效应,表明MPO可能通过调节BBB的通透性参与SRS的发生,开发新的靶向于MPO的抗炎药物对癫痫的治疗具有重大意义。