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甘草为豆科多年生草本植物甘草、光果甘草、黄甘草、胀果甘草的干燥根及根茎,始载于神农本草经,列为上品。现已证明,甘草除具有镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等作用外,还能增强机体免疫功能,防治病毒性肝炎、抗癌、抗艾滋病。其主要有效成分是多种三萜化合物和多种黄酮类化合物。本实验室在前期的研究中通过体外药物筛选实验首次发现甘草水提主要有效成份之一黄酮类化合物甘草苷(liquiritin,LQ)为对人乳腺癌细胞系(human breast carcinoma cells MCF-7)基本无增殖作用的雌激素β受体(ERβ)选择性激动剂,推测其可能像雌激素激动剂一样影响阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)相关的多个病理环节的,同时还能避免雌激素致癌副作用。至今为止,未见LQ针对AD的神经保护及营养作用方面的文献报道,本研究从分子水平、细胞水平和整体动物水平研究其作用及作用机制,为开发新类型的治疗AD药物提供实验依据。1.甘草苷对原代海马神经细胞的保护及营养作用采用大鼠原代海马神经元Aβ25~35损伤模型,四甲基偶氮唑盐(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)法测定细胞活力、流式细胞术检测神经细胞凋亡、荧光探针法检测细胞内钙离子浓度和活性氧(ROS)水平,试剂盒检测乙酰胆碱酯酶(AchE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)活力考察LQ神经保护作用;通过考察LQ诱导海马神经元轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用。研究结果显示10μmol·L-1 Aβ25~35显著降低细胞的存活率,明显升高细胞上清LDH值;显著升高细胞内钙离子水平和ROS值;诱导细胞凋亡发生,凋亡率达(27.67±1.57)%。预先给预0.1、1和10μmol·L-1浓度的LQ处理细胞6小时,可显著抑制Aβ25~35导致的细胞死亡,明显降低LDH值,能够明显降低Aβ25~35导致的细胞内钙离子浓度升高及ROS增多,流式细胞检测凋亡率分别降低到(22.06±1.35)%、(14.68±1.39)%和(10.28±0.46)%,阳性药雌激素(E2)能够有效降低细胞凋亡率至(6.19±1.00)%,提示LQ能够像雌激素一样拮抗Aβ25~35导致的细胞凋亡。雌激素受体(ER)完全阻断剂ICI 182 780可以部分阻断LQ的抗细胞凋亡作用,说明LQ抗Aβ的神经保护作用至少部分是通过ER途径实现的。细胞增殖试验结果表明,10-4～10μmol·L-1浓度范围的LQ作用72h后细胞并未增殖,排除LQ因对细胞增殖而提高细胞存活率作用。酯酶测定结果显示,LQ能够明显抑制AchE活力,对BuChE没有明显的抑制作用。提示LQ可能通过抑制AchE活力来对AD的治疗起到一定的作用,而且可以避免外周胆碱能系统的副作用。LQ能够显著增加神经生长因子(NGF)介导的海马神经元轴突延长,特异性的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂能够部分阻断该作用。另外,LQ可以诱导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元。因此,LQ可明显减轻Aβ25~35导致的大鼠原代神经细胞损伤作用,同时甘草苷对原代海马神经元有营养作用。2.甘草苷抗炎作用将带有7个串联NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-NF-κB-SEAP和含潮霉素质粒pTK-HygB采用脂质体共转染法转入人胚肾(HEK293)细胞中,用潮霉素B筛选稳定表达克隆细胞株,进一步用脂多糖(LPS)诱导报告基因分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)表达的阳性克隆。采用此阳性克隆细胞株验证LQ对NF-κB信号通路的抑制作用。实验结果显示,0.1、1、10μmol·L-1浓度的LQ对LPS诱导的NF-κB信号通路的抑制率分别为(61.5±1.1)%、(79.6±2.0)%和(90.8±2.1)%,表明LQ对NF-κB信号通路有抑制作用。其抗炎作用可能是可能是LQ神经保护作用机制之一。3.甘草苷对小鼠学习记忆的促进作用昆明小鼠60只,随机分为正常对照组、模型组、哈伯因阳性对照组、LQ高、中、低各剂量组,每组10只。氢溴酸东莨菪碱腹腔注射制备小鼠记忆获得障碍模型,采用行为药理学试验方法——跳台和Morris水迷宫考察LQ对东莨菪碱所致学习记忆障碍的改善作用,评价小鼠空间学习能力;试剂盒检测小鼠全脑组织匀浆上清胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和血清丁酰胆碱酯酶(BuChE)活力。采用免疫组化法测定脑M1受体含量,HE染色观察脑组织是否病变,尼氏染色观察脑神经细胞。研究结果显示,5mg·kg-1氢溴酸东莨菪碱腹腔注射明显造成了小鼠空间学习记忆障碍,显著缩短跳台实验中测验阶段小鼠的潜伏期,明显增加错误次数;水迷宫上台潜伏期显著延长。哈伯因和LQ明显延长小鼠跳台潜伏期,减少错误次数;显著缩短水迷宫实验中小鼠找到安全台的时间。生化指标测定结果显示,哈伯因和LQ能够显著降低氢溴酸东莨菪碱所致脑组织AchE活性升高和升高东莨菪碱所致ChAT活性降低,但仅高剂量的LQ组血清BuChE较模型组有轻微减少,提示LQ能够够提高ChAT活性,抑制AchE活性,从而使Ach含量增多而促进胆碱能神经功能,且可能无外周胆碱能系统副作用。小鼠腹腔注射5mg·kg-1氢溴酸东莨菪碱后脑组织M1受体密度明显降低,而给予哈伯因和LQ组小鼠的M1受体密度较东莨菪碱组明显升高。升高脑内M1受体密度可能是LQ改善或增强小鼠胆碱能系统功能的作用机制之一。尼氏染色结果显示,LQ具有增加或维持原有正常大脑神经元细胞数量,减少东莨菪碱所致脑海马神经元细胞的损害、衰退或坏死等现象的出现。说明LQ具有改善小鼠大脑神经细胞的作用,从而改善小鼠学习记忆的作用。综上所述,LQ具有潜在的抗阿尔茨海默病作用,其机制可能与拮抗Aβ25~35的细胞毒(减少细胞凋亡、拮抗细胞内钙离子超载、降低细胞内活性氧升高程度)、选择性抑制乙酰胆碱酯酶和促进M1胆碱受体表达、抑制由NF-κB介导的炎症和增强神经生长因子的神经营养作用有关,作用特点在于拮抗损伤和神经营养作用并举,从而有可能从根本上逆转AD病情,并且LQ对AD起到一定的多靶向治疗作用,可能被开发为新一代高效低毒的抗AD药物。