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涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),是涎腺最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于涎腺恶性肿瘤的第二位。该肿瘤具有侵袭性强、浸润性生长、易复发的特性,其主要的生物学性状之一是侵犯神经、血管,常沿血行转移至肺、肝、骨等重要器官,其中以肺部最为多见,其血行转移率高达47.8%。目前涎腺腺样囊性癌的治疗手段以手术为主,但手术难以彻底,术后复发率较高,远期疗效不理想,传统的放化疗方法疗效果不显著,所以,寻求新的治疗方法成为热点,利用中药里提取的有效成分影响癌细胞的侵袭就是当中之一。多被银莲花(Anemone Raddeanin Regel)是中药毛茛科植物的干燥根茎,药材味辛、热、有毒、归脾经,具有祛风湿、消肿痛之功效。多被银莲花总皂甙是多被银莲花经水解和溶剂萃取而来。口服多被银莲花总皂甙200mg/kg,实验结果表明对艾氏腹水癌、肉瘤180、宫颈癌的抑制率分别达49%,59%,84%。皂甙D对腹水型肝癌(AH)细胞抑制率为81%,在体外能显著抑制小鼠180和腹水型肝癌细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成,其抑制率随时间的延长而增加,其中皂营D(竹节香附素R3)抗癌效果显著。近年的研究表明,多被银莲花总皂甙可抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。Survivin基因是耶鲁大学的Ambrosini等在1997年通过Effector Cell Protease Receptor-1,EPR-1的c DNA从人类基因组库中用杂交筛选的方法第一次分离出来,属于凋亡蛋白抑制因子家族的一员,能特异的表达于人和鼠的胚胎发育细胞及多数肿瘤细胞,其表达量与放、化疗、的敏感性及肿瘤细胞的凋亡过程关系密切。目的:本实验采用水解和溶剂萃取的方法,从中药多被银莲花中提取分离得到总皂甙。用不同浓度多被银莲花总皂甙处理体外培养的人涎腺腺样囊性癌高肺转移细胞(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonary metastasis,ACC-M)后,观察不同时间点的ACC-M细胞对Transwell小室侵袭的情况;ACC-M细胞经多被银莲花总皂甙处理后,应用Western Blot技术检测Survivin蛋白表达含量的变化。方法:1材料ACC-M细胞:北京口腔医院提供;多被银莲花总皂甙:购买于石家庄乐仁堂药店(产地为黑龙江省),于河北医科大学药学院经溶解与溶剂萃取提纯得到;Matrigel;Transwell小室(跨膜细胞培养器,膜的孔径8μm)等。2方法(1)药液配制:多被银莲花总皂甙用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成20mg/m L储备液,前用使用培养液稀释。(2)细胞培养:采用加入10%胎牛血清与青霉素(100U/m L)、链霉素(100μg/m L)的RPMI1640培养基,在恒温箱内饱和湿度培养(37℃、5%CO2),24~48小时传代1次,用0.04%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)与0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液消化传代。(3)待细胞贴壁(接种24时)后,以药物浓度为50ug/m L进行药物处理,待药物作用24、48、72小时后,应用Western Blot法检测Survivin蛋白在ACC-M细胞中的表达。(4)Transwell小室下室内加入含有化学趋化物肝细胞生长因子(HGF)的10%的细胞培养液200μl(30ng/200μl),上室膜的底面预先铺好Matrigel 50μl;在每个Transwell小室的上室中加入用0μg/m L(作为空白对照),0.1μg/m L,1μg/m L,10μg/m L,与100μg/m L的多被银莲花总皂甙在37℃,处理20min的ACC-M细胞悬液(含有2×105个处于对数生长期的ACC-M细胞)200μl,37℃,5%CO2条件下孵育。每组3个复孔。孵育24h、48h、72h后,计算侵袭抑制率,公式如下:(对照小室穿膜细胞数均值-处理小室穿膜细胞数均值)/对照小室穿膜细胞数均值×100%;(5)统计处理:实验重复三次,收集所得的实验数据,应用统计学方法分析实验结果。结果:Westeron Blot结果显示:50ug/m L多被银莲花总皂甙作用72小时后,经灰度值分析(Table 2)Survivin表达量与对照组相比减少了50.4%,差异显著(P<0.05)。Transwell结果显示:实验组较对照组比较,实验组穿过上室底面膜的细胞数少,且细胞数随浓度增大呈递减趋势,细胞侵袭抑制率就有时间依赖性与浓度依赖性,其中72小时,100μg/m L时,侵袭抑制率可达到89.64%。统计学分析结果显示:相同处理时间,不同处理浓度之间存在明显差别呈浓度依赖性,(P<0.05);相同处理浓度,不同时间之间存在明显差别呈时间依赖性(P<0.05)。结论:多被银莲花总皂甙可以降低凋亡抑制蛋白Survivin的表达率,抑制ACC-M细胞的侵袭,与对照组相比具有显著性差异;多被银莲花总皂甙抑制ACC-M细胞的侵袭与药物浓度之间具有依赖性,随药物浓度的增加,侵袭抑制率增高;侵袭抑制率和药物作用时间具有依赖性,随作用时间的增加侵袭抑制率增高。