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目的构建靶向TNF-α基因的shRNA载体,观察其对脊柱结核破骨细胞形成的影响,为后续脊柱结核骨质破坏的干预性研究奠定基础。方法结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)诱导小鼠RAW264.7细胞,采用细胞增殖与毒性(CCK)试验检测PPD对细胞增殖的影响,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的形成,比较不同剂量(0、2、20、50、100μL)及诱导时间(1、4、7天)条件下,破骨细胞形成的差异。通过q PCR和Western Blotting检测PPD诱导1、4、7天TNF-α的表达。双酶切法构建靶向TNF-α基因的shRNA,经脂质体转染RAW264.7细胞,荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR观察转染后1、3、5、7天TNF-α基因的表达,收集转染后第三天的细胞,q PCR检测转染后TNF-α和RANK基因的表达,Western Blotting检测TNF-α蛋白的表达,TRAP染色计数转染后第7天破骨细胞形成的数量。结果PPD抑制RAW264.7细胞的增殖;TRAP染色可见破骨细胞形成;不同剂量PPD诱导破骨细胞形成的数量:PPD 0μL组为(58.067.1±)个、2μL组(58.067.4±)个、20μL组(52.067.16±)个、50μL组(89.267.10±)个、100μL组(58.033.1±)个;20μL PPD诱导1、4、7天破骨细胞形成的数量:1天组为(1.50±0.55)个、4天组为(7.50±1.87)个、7天组为(17.33±2.07)个;PPD诱导1、4、7天TNF-α基因的表达量为:对照组:(1±0),1天组:(4.267±0.737),4天组:(13.60±0.648),7天组:(14.07±1.013),TNF-α蛋白的表达量,对照组为:(0.066±0.004),1天组:(0.081±0.005),4天组:(0.162±0.003),7天组:(0.179±0.005);转染前后TNF-α基因的表达量:转染前为(1.426±0.086),转染后为(0.464±0.029);转染前后RANK基因的表达量:转染前为(1.393±0.007),转染后为(1.154±0.006);转染前后TNF-α蛋白的表达量:转染前为(82.72±1.843),转染后为(55.34±0.824);转染前后破骨细胞形成的数量:转染前为(56.67±3.786)个,转染后为(19.33±1.528)个。结论PPD可以诱导破骨细胞形成,且破骨细胞形成与PPD之间只有时间依赖性,无剂量依赖性;TNF-α在脊柱结核破骨细胞的形成中起着重要的作用,TNF-α基因shRNA能使TNF-α的表达下调,并抑制破骨细胞的形成。