骨折、肿瘤、骨质疏松等引起的骨缺损是一个常见的临床问题,严重影响患者的生活质量。在各种修复骨缺损的方法中,金标准是自体骨移植。然而,自体骨移植仍然存在一些问题,如骨量有限和继发性创伤,限制了其临床应用。为了克服这些问题,近年来,组织工程骨再生策略应运而生,在过去几十年中已成为研究的热点之一。骨形态发生蛋白（BMP）由于其强大的成骨能力而被广泛使用,并且是目前唯一可作为骨移植物替代物的市售治疗剂。然而,研究表明,BMP在骨缺损治疗中的临床应用可能产生副作用,甚至导致治疗失败。除异位骨形成和炎症外,甚至会导致骨溶解,使骨愈合效率低下,甚至增加了微骨折的风险。BMP和WNT信号在骨发育、稳态和再生中发挥关键作用,但二者存在复杂的正向和负向的相互作用。因此,寻找合适的手段和方法激活BMP和WNT信号通路,使二者发挥协同作用,同时抵消二者的相互抑制作用,是达到骨再生的更有效途径。由于蛋白质存在价格昂贵和半衰期短等问题,本研究拟应用小分子化合物达到激活信号通路的目的。在第1章中,我们阐述了本研究的背景和立项依据,综述了骨组织工程中种子细胞、生长因子和支架材料的研究进展和存在问题,引出了本课题的研究思路:针对骨缺损修复过程中的骨组织工程存在的问题,受莼菜茎部特殊的双层结构的启发,拟利用海藻酸纳（Alginate,ALG）和壳聚糖（Chitosan,CS）合成双层水凝胶,并负载能激活BMP和WNT信号通路的小分子药物,使其达到次第释放并顺序激活相应信号通路的目的。在第2章中,我们利用交联法制备了ALG/CS水凝胶,通过扫描电镜、压缩强度测试、降解实验和释放实验对其表面形貌、力学性能、体外降解及药物释放性能进行表征。结果表明,所合成的ALG/CS水凝胶内外双层具有不同的结构,可负载小分子药物并达到次第和缓慢释放药物的目的。在第3章中,我们首先筛选了小分子药物的应用浓度,确定了药物的作用模式,然后制备不同组别的载药ALG/CS水凝胶。通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色和RT-PCR等方法,检测了载药ALG/CS水凝胶对小鼠颅骨前成骨细胞分化的影响。结果表明,所合成的不同组别的载药ALG/CS水凝胶能不同程度地促进体外培养的成骨细胞的成骨向分化,其中,先释放FK506后释放BIO的载药ALG/CS水凝胶能较其他组别更显著地促进成骨细胞分化。在第4章中,我们首先通过皮下植入模型和骨缺损局部植入模型评估了载药ALG/CS水凝胶的生物安全性和生物相容性;其次建立了大鼠颅骨临界骨缺损和大鼠股骨临界骨缺损两种模型,植入载药ALG/CS水凝胶术后4周和8周,分别通过micro-CT和组织学评估了骨缺损区域的新骨形成及新骨的质和量。结果表明,所合成的载药ALG/CS水凝胶的局部应用表现出较好的生物安全性和生物相容性,不同组别均可促进皮质骨和松质骨缺损的修复,其中先释放FK506后释放BIO的载药ALG/CS水凝胶较其他组别能加速骨缺损的修复和骨组织的成熟。在第5章中,我们初步探讨了载药ALG/CS水凝胶在体外促进成骨细胞分化和体内促进骨缺损修复的可能机制。通过Transwell迁移实验和Western blot检测,明确了载药ALG/CS水凝胶能不同程度地促进BMSCs的迁移,可能是其在体内植入骨缺损区域招募干细胞到达骨缺损区域并促进骨再生的原因;此外,载药ALG/CS水凝胶能次第释放外层和内层的小分子药物,达到顺序激活BMP和WNT信号通路的目的,可能在骨缺损的修复过程中发挥了BMP和WNT信号通路的协同作用,消除了二者的相互抑制作用。综上,本研究制备了一种仿莼菜结构的载药ALG/CS水凝胶,成功地实现了BMP信号通路激活剂和WNT信号通路激活剂的缓慢和次第释放。通过体外和体内研究评估了载药ALG/CS水凝胶的生物安全性和生物相容性,以及体外和体内促成骨细胞分化和新骨形成的作用及机制,为临床上治疗骨缺损破坏性疾病以及加快骨损伤修复奠定理论基础和实验依据。