论文部分内容阅读
酿酒酵母因其具有优良的生长和发酵性能,而被广泛应用于乙醇工业。在发酵过程中,有很多不可避免的胁迫环境如高温、高渗等出现,这些环境会抑制细胞生长和降低细胞发酵能力,给相关发酵行业带来一定的经济损失。cAMP信号通路在调控酵母细胞代谢、增殖、分化及压力抗性的获得过程中具有重要的作用。本研究通过调控cAMP信号通路及其支路中的关键基因,进而达到使酵母细胞具有良好耐受性的同时能够正常发酵的目的。本文构建的具有良好耐受性的突变株在工业应用方面具有重要的意义。主要研究内容及结果如下:(1)以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因为筛选标记,分别利用长引物敲除法和胞内重组法实现RAS2基因的敲除和PDE2基因的过表达,最终通过PCR验证,成功构建敲除RAS2基因的突变株AY12a-ras2△和过表达PDE2基因的突变菌株AY12a-pde2。对突变株进行耐受性的测定,发现AY12a-pde2有一定的耐高温性能。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48 h细胞存活率、CO2失重及发酵时间。结果突变菌株AY12a-pde2的酒度提高了7.05%,而突变株AY12a-ras2Δ的酒度较AY12a有所下降。(2)以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因作筛选标记,利用胞内重组,在MSN2、MSN4和GIS1基因的N端加上强启动子PGK1p以实现基因的过表达,最终通过PCR验证,成功构建突变株AY12a-msn2、AY12a-msn4和AY12a-gis1。对酵母进行耐受性的测定,发现除AY12a-msn2外均具有一定的耐高温性能。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48 h细胞存活率、CO2失重及发酵时间。结果发现突变株AY12a-gis1和AY12a-msn4酒度分别提高5.13%和3.85%,48 h细胞存活率上升,残糖含量下降,而突变株AY12a-msn2酒度下降,且其发酵时间最长。(3)以实验室现有菌种AY12a为出发菌株,URA3基因为筛选标记,利用长引物敲除法对SCH9和TOR1基因进行敲除,最终通过PCR验证,成功构建敲除SCH9和TOR1基因的突变株AY12a-sch9△和AY12a-tor1Δ。对其进行耐受性的测定,发现AY12a-sch9Δ具有一定的耐高温性和乙醇耐受性。同时将突变株与AY12a进行玉米高温浓醪发酵,并测定发酵完成后的酒度、残糖、48h细胞存活率、CO2失重及发酵时间。结果AY12a-sch9Δ的酒度较出发菌株提高8.33%,48h细胞存活率提高,残糖含量下降,发酵时间延长,而突变株AY12a-tor1Δ的酒度较AY12a有所下降。