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研究背景和目的：炎症性肠病发病率呈逐年上升趋势，其病因及发病机制目前尚不明确。Tim-3是2001年发现的TIM家族中的重要一员，有研究表明IBD中Tim-3表达异常。TLRs信号通路作为连接固有免疫及适应性免疫的桥梁，既是机体防御病原体入侵的重要门户，又是炎症反应的启动闸门，大量文献报道已确认TLRs信号通路异常在IBD发病中起重要作用。近年来有研究显示Tim-3和TLR4信号通路在免疫相关疾病中可互为调控，但目前尚未见两者在IBD中共同发挥作用的报道。我们的前期研究显示，实验性结肠炎鼠模型中TLR4信号通路过度激活，用Tim-3单抗处理后可使肠粘膜中Tim-3表达上调，TLR4信号通路关键分子MyD88表达下调，提示Tim-3与TLR4均参与IBD的发生发展。本文旨在体外采用Tim-3过表达质粒转染小鼠源性巨噬细胞RAW264.7，明确Tim-3对巨噬细胞中TLR4/LPS信号通路是否有影响，探讨Tim-3及TLR4/LPS信号通路在IBD中的作用。研究方法：㈠LPS对巨噬细胞内TLR4信号通路和Tim-3的影响培养小鼠巨噬细胞RAW264.7至对数生长期，给予不同浓度LPS分别作用6h、12h后收集细胞(重复3次)。实验分组如下：①对照组：巨噬细胞+DMEM培养基；②实验组1：巨噬细胞+含10ng/ml LPS的DMEM培养基；③实验组2：巨噬细胞+含100ng/ml LPS的DMEM培养基；④实验组3：巨噬细胞+含1ug/ml LPS的DMEM培养基；⑤实验组4：巨噬细胞+含10ug/ml LPS的DMEM培养基；㈡Tim-3过表达对巨噬细胞内TLR4/LPS信号通路及促炎因子分泌的影响⑴Tim-3重组真核表达质粒的构建及鉴定①分离小鼠脾脏单个核细胞，设计针对Tim-3基因的特异性引物并扩增目的基因。②将Tim-3扩增产物插入到pLVX-IRES-ZsGreen1载体，构建重组质粒。扩增、提取重组质粒，并采用酶切及测序鉴定。⑵Tim-3重组真核质粒的表达采用阳脂质体转染技术将pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3转染RAW264.7细胞，观察有无荧光及荧光强度，并收集细胞检测Tim-3的mRNA及蛋白表达水平(重复3次)。⑶Tim-3过表达对巨噬细胞内TLR4/LPS信号通路及促炎因子分泌的影响实验分组：①未转染组：未转染的小鼠巨噬细胞RAW264.7；②空质粒组：转染空质粒的小鼠巨噬细胞RAW264.7；③Tim-3质粒组：转染Tim-3质粒的小鼠巨噬细胞RAW264.7；上述各组再分为LPS作用与无LPS作用两组，选择LPS作用的最佳浓度和时间点(1ug/ml，6h)，6h后收集细胞及细胞培养上清(重复4次)。⑷检测方法：①实时荧光定量PCR方法检测细胞内Tim-3、TLR4、MyD88mRNA的表达。②免疫印迹方法检测细胞内Tim-3、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白的表达。③固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量。研究结果：㈠LPS对巨噬细胞内TLR4信号通路的影响：①不同浓度LPS作用巨噬细胞6h，在0-1ug/ml浓度范围内，巨噬细胞内TLR4、MyD88、Tim-3mRNA表达随LPS浓度升高而增加，其中1ug/ml LPS组显著高于其他浓度组(P<0.05)。作用12h，100ng/ml LPS组TLR4mRNA的表达显著高于其他浓度组(P<0.05)，而各组间MyD88、Tim-3mRNA表达无显著性差异(P>0.05)。②LPS作用巨噬细胞不同时间，在0-1ug/ml浓度范围内，6h组TLR4和MyD88mRNA表达均高于12h组，其中1ug/ml LPS作用6h组显著高于对应的12h组(P<0.05)。此外，1ug/ml LPS作用6h组Tim-3mRNA表达也显著高于对应的12h组(P<0.05)。㈡Tim-3过表达对巨噬细胞内TLR4/LPS信号通路及促炎因子分泌的影响⑴Tim-3重组真核表达质粒的构建及鉴定成功构建pLVX-IRES-ZsGreen-Tim-3重组表达质粒，酶切后电泳显示两条带，其分子量大小与预期相一致。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库(GenBank Accession: AF450241.1)中的Tim-3基因序列相似性为100%。⑵Tim-3重组真核质粒的表达Tim-3重组质粒转染RAW264.7细胞后，在荧光显微镜下可见绿色荧光。细胞内Tim-3mRNA及蛋白表达显著高于未转染组(P<0.05)，提示转染成功。⑶Tim-3过表达对巨噬细胞内TLR4/LPS信号通路及促炎因子分泌的影响①各组细胞内Tim-3mRNA及蛋白的表达：无论有无LPS作用，转染Tim-3的巨噬细胞内Tim-3mRNA及蛋白表达均显著高于未转染Tim-3组(P<0.05，P<0.01)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05)。②各组细胞内TLR4mRNA及蛋白的表达：在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞内TLR4mRNA及蛋白表达均显著高于未转染Tim-3组(P<0.05)；而在无LPS作用组，转染与未转染组间无显著性差异(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组TLR4mRNA及蛋白的表达均显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05)。③各组细胞内MyD88蛋白的表达：在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞内MyD88蛋白表达显著高于未转染Tim-3组(P<0.05)；而在无LPS作用组，转染与未转染组间无显著性差异(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组MyD88蛋白的表达均高于对应的无LPS作用组，其中未转染组和转染Tim-3组差异有统计学意义(P<0.05)。④各组细胞内pNF-κB p65蛋白的表达：在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞内pNF-κB p65蛋白表达显著高于未转染Tim-3组(P<0.05)；而在无LPS作用组，转染与未转染组间无显著性差异(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组pNF-κB p65蛋白的表达均显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05)。⑤各组细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量变化a在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞培养上清中TNF-α的含量显著高于未转染Tim-3组(P<0.05)；而在无LPS作用组，转染Tim-3对TNF-α的含量无显著影响(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组TNF-α的含量均显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05)。b在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞培养上清中IL-6的含量显著高于未转染组(P<0.01)；而在无LPS作用组，转染Tim-3对IL-6的含量无显著影响(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组IL-6的含量均显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05，P<0.01)。c在LPS作用组，转染Tim-3的巨噬细胞培养上清中IFN-γ的含量高于未转染Tim-3组，但差异无统计学意义(P>0.05)；在无LPS作用组，转染Tim-3对IFN-γ的含量无显著影响(P>0.05)。同时，无论有无转染Tim-3，LPS作用组IFN-γ的含量均显著高于对应的无LPS作用组(P<0.05，P<0.01)。结论：1、LPS可激活小鼠巨噬细胞TLR4信号通路及上调Tim-3的表达，促进促炎因子分泌，且在一定范围内呈浓度依赖性。2、在无其它因素作用下，Tim-3过表达对小鼠巨噬细胞TLR4信号通路及促炎因子分泌无明显影响。3、在LPS作用下，Tim-3过表达可增强小鼠巨噬细胞TLR4信号通路的激活，并促进促炎因子分泌。