喉癌中SP100表达及生物学功能研究前言喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,发病率约占全身肿瘤的1-5%,并且发病率呈不断增长的趋势：北美每年有13000例患者被诊断为原发性喉癌；在我国,喉癌的发病率在呼吸系统恶性肿瘤中占据第二位,华北、东北地区是喉癌的高发区。手术是目前治疗的主要手段,尽管早期喉癌患者的生活质量由于喉部分切除术的应用得到了较大的改善,但晚期喉癌患者的生活质量及生存率在最近的30年中无明显变化。喉癌发生的病理分子机制仍不清楚,探讨其发生、发展的分子机制无论对喉癌的早期诊断,还是有效治疗都具有重要意义。在前期的工作中,我们发现在喉癌组织中表达下调的SH3GL2蛋白在喉癌细胞系中可以和SP100蛋白结合而相互作用,提示SP100蛋白可能与喉癌的发生和进展相关,在喉癌发生演进中发挥一定的作用。SP100蛋白,全名为SP100核抗原(SP100 nuclear antigen),属早幼粒白血病核小体(promyelocytic Leukaemia nuclear body, PML NBs)相关蛋白家族成员,含有SP100HMG, SP100A, SP100B和SP100C四种异构体。4种SP100蛋白异构体在氨基端共享同源SP100结构域,不同异构体在羧基端的SAND, PHD (plant homeodomain zinc finger), Bromo或HMG (High Mobility Group,高迁移率组)结构域存在差别。SP100蛋白已被证实参与病毒感染、病毒相关蛋白相互作用、自身泛素化调节,并在干扰素、p53等多个信号通路中发挥作用。目前有关其在人体肿瘤中的研究尚未见报道。在本研究中,我们将明确SP100基因在不同肿瘤细胞系及喉癌大体组织标本中的表达方式。同时,深入研究SP100HMG的生物学功能及其与SH3GL2蛋白的相互作用方式。一方面可为阐明SP100基因在喉癌发生和发展过程中的分子机制创造条件并提供新的线索,另一方面为开展以SP100HMG为靶点或通过蛋白相互作用设计竞争性抑制剂的喉癌诊断和治疗奠定基础。材料与方法通过半定量PCR和实时定量PCR分别检测SP100基因mRNA在人喉癌Hep2细胞系、人宫颈癌HeLa细胞系、人肝癌Be1细胞系、人胃癌SGC7901和BGC823细胞系、人胚肾HEK293细胞系和胎儿胃上皮GES细胞系中的表达情况。选取2004年1月一2006年12月于中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科诊断为喉鳞状细胞癌的病例96例,收集喉癌组织及癌旁黏膜组织标本及相应病例临床资料,采用RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学方法研究SP100基因在喉癌大体组织标本中表达情况,应用统计学方法分析临床病理资料与SP100表达间的关系。通过RT-PCR分析SPIOOHMG转录本在人喉癌Hep2细胞系、人宫颈癌HeLa细胞系、人肝癌Bel细胞系、人胃癌SGC7901细胞系、BGC823细胞系、MKN细胞系、人胚肾HEK293细胞系和胎儿胃上皮GES细胞系中的表达情况；构建RFP-SP100HMG表达载体,转染Hep2细胞,通过Western blot和RT-PCR检测Hep2细胞中SP100HMG表达水平,同时观察转染后细胞形态学、细胞增殖能力、细胞体外侵袭能力和细胞凋亡水平的变化,综合分析SP100HMG在喉癌细胞中的生物学功能。通过免疫共沉淀技术和免疫荧光技术分析SP100HMG和SH3GL2蛋白结合及区域定位；通过生物信息学技术对SP100HMG-SH3GL2结合区域进行预测,构建该结合区域肽链表达载体、通过免疫共沉淀对SP100HMG-SH3GL2的蛋白结合区域进行验证,进一步揭示其参与蛋白质间结合的肽链片段。结果1、半定量和实时定量RT-PCR结果表明Hep2、HeLa. Bel、SGC7901、BGC823肿瘤细胞系中SP100 mRNA水平较黏膜上皮细胞系GES降低；2、RT-PCR和Western blot结果显示,喉癌组织中SP100 mRNA和蛋白表达水平均低于癌旁对照组织,蛋白表达下调水平与mRNA表达下调水平一致；3、免疫组织化学分析SP100蛋白表达位于细胞核和细胞质,蛋白表达水平与喉癌细胞病理分化程度相关,低水平表达时SP100蛋白从细胞核向细胞质移位；4、RT-PCR结果显示在Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823、MKN肿瘤细胞系中SP100HMG mRNA水平较黏膜上皮细胞系GES降低；5、RFP-SP100HMG表达质粒转染Hep2细胞后,细胞中SP100蛋白表达水平显著增加,RT-PCR显示SP100HMG表达水平亦显著增加；6. SP100HMG对人喉癌Hep2细胞生物学行为的影响：RFP-SP100HMG表达质粒转染Hep2细胞可以观察到明亮的红色荧光蛋白表达,转染细胞形态明显变圆、边缘变钝,细胞凋亡率增高、侵袭力显著降低,细胞增殖水平较对照组细胞无明显变化；7、免疫共沉淀显示SP100HMG和SH3GL2在Hep2细胞内结合,免疫荧光显示SP100HMG定位于细胞核,SH3GL2定位于细胞核和细胞质,二种蛋白结合区域定位于细胞核；8、生物信息学预测并经免疫共沉淀实验证实SP100HMG蛋白与SH3GL2蛋白结合位点位于SAND-HMG区域。结论4、SP100mRNA在多个恶性肿瘤细胞系中表达下调,参与肿瘤的发生发展；2、喉癌组织中SP100在转录和翻译水平上表达下调,是潜在的喉癌相关的抑癌基因；3、喉癌组织中SP100蛋白表达水平、细胞内分布状况在不同分化程度癌细胞中存在显著差异性,提示在喉癌的不同阶段可能发挥不同的作用；4、SP100HMG在不同肿瘤细胞系中表达水平较正常黏膜上皮细胞系表达下调,在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥作用；5、SP100HMG具有抑制喉癌细胞侵袭并增强细胞凋亡的能力,是喉癌相关的重要候选肿瘤抑制基因；6、SP100HMG通过SAND-HMG结构域与SH3GL2在细胞核内结合,提示SP100HMG和SH3GL2可能通过形成复合体方式调节下游基因转录活性。