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研究目的建立能够使用活体成像监测肿瘤生长的人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型,同时对其两种造模方式,即细胞悬液原位注射(COI)和组织块原位移植(SOI),进行成瘤率、活体成像、肿瘤生长和转移及肿瘤微环境等方面的比较,并使用该模型通过体内筛选建立人卵巢癌网膜高转移亚细胞系及卵巢癌网膜高转移小鼠模型;鉴定卵巢癌网膜转移前微血管内皮细胞(MVECs)活化的存在,并探讨卵巢癌细胞刺激MVECs活化的功能改变。研究方法1.慢病毒转染建立稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的卵巢癌稳转细胞系;2.稳转细胞系建立COI和SOI模型后,使用生物发光活体成像监测肿瘤成瘤、生长和转移;观察结束,解剖对比两组模型原发瘤体积及腹腔转移情况;3.分别使用EdU和划痕实验检测形成COI和SOI肿瘤的细胞增殖和迁移能力的差别;4.通过免疫组化染色检测两组肿瘤组织中癌相关成纤维细胞标志物α-SMA、基质金属蛋白酶MMP2和MMP9、CD34标记的微血管密度、上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin及细胞增殖核抗原Ki67的表达水平差异。5.使用卵巢癌稳转细胞ES2-luc,建立SOI原位移植瘤,进行三次原位移植-网膜转移循环的体内筛选;6.取第三代小鼠网膜转移灶经原代提取后建立高转移亚细胞系;7.体外实验:用EdU、transwell迁移侵袭实验、matrigel粘附实验、平板克隆形成实验以及流式细胞术检测细胞失巢凋亡,对高转细胞进行功能表型鉴定;8.体内实验:高转细胞及亲代细胞分别建立原位移植瘤模型,对比其成瘤、肿瘤生长及转移;9.HE染色及CD34、CD105免疫组化观察两组小鼠网膜转移及血管生成变化。10.收集临床卵巢癌手术患者的网膜标本,免疫组化进行泛血管标志物CD34、MVECs活化标志物CD105染色;11.差异过滤法提取无转移网膜原代MVECs,并通过免疫细胞化学染色(ICC)和流式细胞术进行表面标志物的鉴定;12.用癌细胞条件培养基(CM)刺激MVECs,通过EdU增殖实验、划痕实验、transwell迁移侵袭实验、matrigel管腔形成实验、内皮细胞渗透性实验检测其各功能的变化,Western blot检测MVECs增殖活化标志物CD 105表达水平的变化;研究结果1.通过慢病毒转染,成功建立两株可用于活体成像的卵巢癌稳转细胞系ES2-1uc和SKOV3-luc;使用该两株稳转细胞系成功建立了 COI和SOI小鼠原位移植瘤模型。两种模型中成瘤率分别为87.5%和100%。可疑细胞渗漏在COI中的发生率为37.5%;2.解剖及活体成像观察发现SOI肿瘤生长得更快,转移性较COI肿瘤更强;3.EdU及划痕实验结果显示,形成SOI肿瘤的癌细胞体外迁移和增殖能力明显较形成COI肿瘤的细胞更强;4.免疫组化检测发现,相较COI肿瘤,SOI基质中含有更多癌相关成纤维细胞及MMP2、MMP9,微血管密度更高;5.通过SOI模型的体内筛选,第一、二、三代小鼠发生转移的时间逐渐提前,生存期逐渐缩短;成功从第三代小鼠网膜转移灶中提取出目标亚细胞群,命名为ES2-luc-OMP3;6.与ES2-luc相比,ES2-luc-OMP3细胞普遍折光性强,呈间质细胞形态,并具有增强的迁移、侵袭、抗失巢凋亡能力,其增殖、克隆形成、粘附能力降低;7.体内实验证实ES2-luc-OMP3转移能力增强,且形成网膜转移的能力增强;网膜转移灶HE染色表明ES2-luc-OMP3细胞对网膜高度浸润,免疫组化证实其接种小鼠网膜中血管生成水平增高;8.已有网膜转移的患者网膜标本中,CD34、CD105阳性的微血管密集存在,而在无转移的早期(FIGO 1期)卵巢癌网膜中,CD34标记微血管稀疏,CD105阳性染色几乎不可见,但在其余部分无转移的网膜中,存在较多CD34、CD105阳性的微血管;9.网膜原代提取的MVECs经纯化培养后,CD34染色阳性,流式检测纯度达90%以上;10.MVECs经癌细胞CM刺激后,CD105表达升高,细胞形态由短圆变得细长,体外实验表明其增殖、迁移、侵袭及成管能力增强,内皮单细胞层渗透性下降。研究结论1.我们分别通过COI和SOI成功建立了卵巢癌小鼠原位移植瘤,并且比较后发现尽管SOI在技术上比COI更为困难且耗时,但SOI建立的模拟临床患者卵巢癌生长和转移的原位移植瘤小鼠模型更为可靠。2.通过SOI模型的体内筛选,我们成功建立了人卵巢癌网膜高转移亚细胞系及原位移植瘤网膜转移小鼠模型,用于卵巢癌网膜转移的体内体外研究。3.卵巢癌患者转移前网膜中存在活化的MVECs,癌细胞可能通过分泌活性物质活化MVEC促进网膜血管新生,从而为卵巢癌网膜转移提供便利条件。