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研究目的1.探讨miR-199a-3p对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。2.探讨下调Rictor表达后PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂对食管鳞癌细胞增殖和凋亡影响的变化情况。研究方法1.q RT-PCR法检测miR-199a-3p在五株食管鳞癌细胞TE1、ECa109、EC9706、KYSE450、KYSE790(其中TE1和EC9706属于低分化细胞株,ECa109、KYSE450和KYSE790属于高分化细胞株)中的表达情况。2.利用si RNA-MateTM转染试剂将人工合成的miR-199a-3p的模拟物mimics转染至食管鳞癌细胞ECa109、EC9706、KYSE450中,q RT-PCR法分别检测转染前后miR-199a-3p在三株细胞中的表达情况。分别采用克隆形成实验、CCK-8法及流式细胞术检测转染前后miR-199a-3p对食管鳞癌细胞增殖及凋亡的影响。3.分别用Western blots和q RT-PCR法检测转染前后三株食管鳞癌细胞中m TORC1信号通路相关因子m TOR、Raptor、p70S6K蛋白及m RNA的表达情况,凋亡相关蛋白Bcl-2以及自噬相关蛋白p62和LC3I/II的表达情况。4.用m TORC1抑制剂RAD001(30μM)处理三株食管鳞癌细胞,q RT-PCR法检测加药前后三株细胞中miR-199a-3p的表达情况。5.用PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂处理筛选的稳定表达Rictor-sh RNA载体的ECa109细胞及未转染细胞,分别采用克隆形成实验和流式细胞术检测下调Rictor表后细胞增殖和凋亡的变化情况。结果1.miR-199a-3p在五株食管鳞癌细胞中均有表达但其表达水平无显著性差异,说明其表达与细胞分化程度无明显相关性。2.与未转染组和转染miR-199a-3p mimics阴性对照组的细胞相比,转染miR-199a-3p mimics的三株食管鳞癌细胞中miR-199a-3p的表达水平均显著升高,且三株细胞的克隆形成能力显著降低,细胞增殖明显减慢,细胞凋亡数显著增加。3.三株食管鳞癌细胞中,与未转染组和转染miR-199a-3p mimics阴性对照的细胞相比,转染miR-199a-3p mimics的细胞中m TOR、Raptor、p70S6K的蛋白和m RNA表达水平均显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著降低,自噬蛋白p62表达水平明显降低,LC3I/II蛋白表达水平明显升高。4.三株食管鳞癌细胞中,与对照组相比,加RAD001的细胞中miR-199a-3p表达量无显著性差异。5.食管鳞癌ECa109细胞中,与未处理组相比,Rictor表达下调的细胞用PI3K/AKT/m TOR通路抑制剂处理后,细胞克隆形成数均明显减少,细胞凋亡数均明显增加。结论1.miR-199a-3p能够抑制食管鳞癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与m TORC1/p70S6K信号通路和细胞自噬有关。2.下调Rictor表达后能增强PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制剂对细胞增殖及凋亡的作用效果。