甘遂(Euphorbia kansui Liou)为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)多年生草本植物,为我国的特有植物,具有重要的药用价值。甘遂中含有一种高度特化的细胞,即乳汁管。该乳汁管为无节分枝乳汁管,其分布可贯穿整株植物,内含有白色的乳汁。近年来,对甘遂的化学成分、药理活性等方面的研究比较多,但对甘遂乳汁管中原生质降解机理方面尚未见详细报道。我们课题组曾利用电子显微技术观察了甘遂乳汁管发育的特点:在乳汁管发育早期,细胞质浓厚,分布有大量的各种细胞器。伴随着乳汁管的发育,一些起源于内质网的小泡状结构常含有乳汁颗粒,他们相互融合,最终与液泡融合。当乳汁管发育成熟后,细胞内只剩下一个充满了乳汁颗粒的中央大液泡和一层薄的细胞质。因此,在甘遂乳汁管发育过程中,部分细胞质和细胞器发生了降解。那么,乳汁管细胞的部分原生质是如何降解的,其原生质降解是否与细胞自噬有关。基于以上问题,本研究以甘遂乳汁管为实验材料,利用Western blot、免疫荧光及激光共聚焦扫描电子显微镜、胶体金免疫电镜以及透射电镜等技术,研究甘遂乳汁管中自噬体的形成及降解过程,探讨细胞自噬与乳汁管生长发育之间的关系,为甘遂乳汁管细胞的发育调控提供理论基础,同时也为深入认识细胞自噬参与植物体生长发育等问题提供基础资料。主要研究结果如下:1.自噬相关蛋白ATG8s常被作为自噬相关结构的标记分子,半胱氨酸蛋白酶(CP)是溶酶体的重要水解酶,可以用来标记溶酶体结构。因此,我们提取甘遂乳汁中的蛋白,通过Western blot技术分析ATG8a蛋白和半胱氨酸蛋白酶(CP)在甘遂乳汁管中的表达。Anti-ATG8a抗体识别出一条分子质量大约为14 kDa的条带,Anti-CP抗体识别出一条分子质量大约为40 kDa的条带,它们的相对分子质量跟预测完全相符,表明AntiATG8a抗体、Anti-CP抗体具有可用性及这两种蛋白是甘遂乳汁管中的内源蛋白。2.分别使用Anti-ATG8a antibody-Alexa Fluor 488和溶酶体红色探针(LTR)双标共定位,Anti-ATG8a antibody-Alexa Fluor 488、LTR和单丹磺酰尸胺(MDC)三标共定位进行免疫荧光分析。在激光共聚焦显微镜下,Anti-ATG8a antibody-Alexa Fluor 488能标记自噬体和自噬溶酶体,呈现绿色荧光;LTR和MDC均能标记溶酶体和自噬溶酶体,分别呈现红色和紫色荧光。实验结果表明:随着茎的发育,乳汁管细胞也逐渐发育直至成熟,其中三种荧光信号强度均呈规律性的变化,即由弱到强再到弱,荧光强度的定量分析也得到相似的结果,此变化规律与乳汁管细胞中原生质的降解过程相吻合,因而细胞自噬参与甘遂乳汁管中原生质的降解过程;此外,LTR的红色荧光和MDC的紫色荧光均能与标记自噬体的ATG8a的绿色荧光共标记,说明乳汁管中存在类溶酶体和自噬溶酶体结构。3.通过透射电镜技术,观察了甘遂乳汁管细胞中细胞自噬过程。在自噬体形成开始,一些来源于内质网的膜会膨大,并延伸到细胞质浓厚或细胞器丰富的区域;然后此膜形成杯状结构,逐渐将被降解物包裹,伴随不断延伸,形成双层膜结构,也就是自噬体。同时,在甘遂乳汁管细胞中还观察到了一些小的来自高尔基体的电子致密的囊泡,我们称之为类溶酶体小泡,它们常常分布于自噬体或即将降解的细胞器周围,且可与自噬体发生融合。此外,在甘遂乳汁管细胞中还观察到自噬溶酶体结构逐渐降解的过程。4.利用免疫胶体金这一免疫学方法,深入分析了甘遂乳汁管中ATG8a蛋白与半胱氨酸蛋白酶(CP)的亚细胞定位。得出结果,Anti-ATG8a抗体标记的金颗粒分布在膨大的内质网膜上,自噬体膜上,以及自噬体腔中;Anti-CP抗体标记的金颗粒主要分布在电镜下看到的电子致密的类溶酶体小泡中,以及类溶酶体小泡周围的自噬相关结构中。综上所述,在甘遂乳汁管发育过程中,内质网膜可包裹细胞质、细胞器而形成双层膜结构,也就是自噬体。它跟类溶酶体小泡进行融合能够形成自噬溶酶体,参与部分原生质的降解。