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评论:本研究的必要性:脓毒症系严重感染引起的系统性炎性反应综合征(SIRS),可导致多器官功能障碍或衰竭。调节性T细胞(Treg)对炎性反应具有重要的负反馈调控作用,可减轻肺损伤。尽管针对Treg已开展了大量的研究,但是脓毒症诱导的肺损伤过程中HMGB1-PTEN信号对Treg活化的调控机制目前国内外尚无报道。本研究的创新点及重要意义:我们率先提出并初步验证了巨噬细胞上HMGB1-PTEN轴在肺的炎性反应过程中对调控Treg具有重要作用HMGB1-PTEN是调控Treg水平的一条重要的信号转导途径,针对这一机制开展的初步探讨可能为ARDS的防治提供了一条潜在的治疗途径。背景:脓毒症由严重感染引起,是ICU患者高死亡率的主要原因。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)系临床脓毒症患者中的常见并发症,同时也是导致脓毒症患者死亡率增高的重要原因。尽管药物研究取得很大的进展,但疗效甚微,这也提示脓毒症诱导炎性反应中的分子机制的复杂性,尚有很多未知亟需进行深入探讨。脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞,经TNF-α或IL-1β介导导致高迁移率族B1(HMGB1)的大量释放,而利用特异性的抗体阻断HMGB1可明显减轻LPS引起的损伤。最新的研究显示,HMGB1在触发先天及特异性免疫反应中扮演重要角色,被认为是一种警示信号(alarmin),最近有报道treg对免疫介导的炎性反应具有重要作用,对lps引起的肺损伤具有保护作用。动物研究证明pten活性的增强可以减少cd4+cd25+tregs的产生且导致生存率下降,t细胞上的pten基因缺陷可以促进il-2受体介导的cd4+cd25+tregs增加,因此pten可能是维持treg稳态的一种重要的调节子。pten的缺乏可引起细胞核内β-catenin的积聚,而敲除pten基因可增强p13k的表达,并减轻了由细菌感染引起的巨噬细胞的炎性反应和急性肺损伤的程度。因此,β-catenin/pdk1/akt信号通路可能在炎性反应过程中具有调控treg产生的重要作用。尽管这方面已进行了相关的研究,但是位于巨噬细胞(先天免疫反应中的主要效应细胞)上的hmgb1-pten信号轴在脓毒症(sepsis)引起的急性肺损伤过程中,对treg的分化是否具有调控作用以及具体分子机制的研究,目前国内外尚无报道,hmgb1在脓毒症性肺损伤过程中究竟如何介导了免疫反应的分子机制也仍未明确。因此亟需进行研究。目的:探讨hmgb1-pten信号对cd4+cd25+foxp3+treg的调节作用及其分子机制,有望为ards的机制研究提供新线索,进而为ards的防治提供一条新途径。方法:本项目拟临床观察结合动物实验,采用实时rt-pcr、凝胶电泳迁移率(electrophoreticmobilityshiftassay,emsa)、westernblot、基因沉默等分子生物学技术,从不同层次探讨ali中hmgb1对cd4+cd25+tregs分化及免疫状态的影响及其作用的关键受体和可能的信号转导途径,具体分为以下几个部分:(1)hmgb1对脓毒症引起的ards患者treg水平的影响:分别检测脓毒症引起的ards患者及健康体检人群的外周血中hmgb1浓度及cd4+cd25+cd127low的水平,进行二者之间的相关性分析。(2)建立lps诱导急性肺损伤的的小鼠模型:采用野生型及特定髓系pten基因敲除的小鼠,分别腹腔注射lps及重组hmgb1(rhmgb1)诱导小鼠的肺损伤模型,观察并评价肺损伤程度(3)进一步检测hmgb1、tgf-β、tnf-α、il-17a、il-23(p-19)及treg的水平,分析hmgb1对tgf-β、tnf-α、il-17a、il-23分泌的影响。(4)分别检测巨噬细胞及t淋巴细胞上的hmgb1、pten、β-catenin、pdk1和akt的蛋白表达,分析hmgb1对pten活性、tregs分化的影响,探讨hmgb1/pten信号在hmgb1诱导小鼠肺损伤中的转导作用。(5)观察ptenm-ko对hmgb1介导ali的保护作用。(6)利用巨噬细胞与t细胞体外共培养技术,采用阻断巨噬细胞hmgb1-pten信号的方法破坏hmgb1-pten轴,观察阻断hmgb1对tgf-β、tregs和β-catenin/pdk1/akt的影响。(7)ptenm-ko对tgf-β、tregs和β-catenin/pdk1/akt信号转导的影响,确定hmgb1-pten信号的调节作用并分析其作用的具体信号转导机制。结果:(1)与健康对照组相比,脓毒症诱导的ards患者血浆中hmgb1的水平明显升高,而treg水平明显下降,且二者之间呈负相关。(2)通过阻断hmgb1或在髓系上特异性敲除了pten基因进行干预,明显减低了lps或rhmgb1诱发的肺损伤的程度,同时tgf-β的水平明显增加,促进了β-catenin/pdk1/akt信号传导,以及treg水平的提高。(3)体外细胞培养实验进一步证实:阻断hmgb1-pten信号导致cd4+cd25+foxp3+treg水平明显增高。结论:临床研究显示:在脓毒症引起的ards患者中,外周血hmgb1的升高与treg水平的下降呈明显相关性。在对lps或rhmgb1处理后的小鼠体内外的研究中,我们进一步发现:hmgb1可以触发髓系上的pten介导的先天免疫反应。髓系上pten基因的缺乏可以促进tgf-β和β-catenin/pdk1/akt信号通路的转导,而该信号通路的激活可诱导CD4+CD25+Foxp3+Tregs的分化,从而减轻由LPS引起的肺炎性反应的程度。提示HMGB1-PTEN信号转导在脓毒症引起ARDS发生机制中具有重要作用。