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研究目的:固有免疫是机体在进化过程中形成的天然防御功能,是抵抗病原微生物感染的第一道防线。Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）作为固有免疫重要组成部分,其家族成员可以识别多种不同的病原微生物结构,引起机体产生一系列抗病原体感染的免疫应答。TLR4信号通路在肠道炎症中起重要作用,对革兰氏阴性菌结构特别敏感,如脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）。NF-κB（Nuclear factorκB）信号通路处于TLR信号通路下游的关键信号通路,TLR/NF-κB信号通路几乎存在所有细胞中,发挥着重要调控作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是一类转录本超过200nt由RNA聚合酶转录而来的非编码RNA分子。Lnc RNA作为一类新的调控因子,在固有免疫中发挥重要调控作用。本课题旨在研究依赖TLR4/NF-κB信号通路的lnc RNA,鉴定并阐明TLR4/NF-κB信号通路调控的lnc RNA在固有免疫中的功能和分子调控机制。方法:1.使用LPS诱导人肠上皮细胞和巨噬细胞系,定量PCR法筛选表达上调的lnc RNA,发现PINT的表达上调最为明显和稳定。用LPS诱导肠上皮细胞和人外周血单核细胞,定量PCR法检测LPS诱导的不同的时间点内PINT的表达情况。同时也检测了TLR1/2和TLR3通路激活剂对PINT表达的影响。2.定量PCR和northern-blot法检测了NF-κB通路抑制剂SC-514对LPS诱导的PINT表达上调的影响。3.荧光报告基因技术和Ch IP-PCR法检测了TLR/NF-κB信号通路如何调控PINT启动子的表达。4.二代测序RNA-seq分析了LPS诱导的细胞中,PINT敲低后细胞内m RNA转录本的变化,筛选同时与PINT和EZH2表达相关的炎症因子。并用定量PCR法进行验证。5.核质分离和RNA原位杂交（RNA-FISH）检测了PINT在细胞中的定位。荧光报告基因技术检测PINT和EZH2在转录水平对相关炎症因子的调控作用。6.荧光报告基因技术,Ch IP-PCR法,碱基定点突变技术,检测了PINT、p65、EZH2如何调控TNF-α启动子表达。并用定量PCR法检测了PINT、p65、EZH2对TNF-α在m RNA表达水平上的协同调控作用。7.RIP、RNA-pulldown、RNA-FISH、荧光免疫（Immunofluorescence,IF）检测了PINT、p65、EZH2相互作用。用RNA-pulldown和Co IP法检测了PINT、p65、EZH2之间互作的方式和关键部位。8.分别分离和培养野生型和TLR4基因敲除型鼠的原代巨噬细胞,用LPS处理,定量PCR检测小鼠lnc RNA Pint的表达情况。RNA-FISH检测了Pint在细胞内的定位情况。通过LPS腹腔注射诱导炎症小鼠模型,定量PCR检测了炎症模型小鼠肠组织内Pint的表达情况。9.定量PCR检测Pint对小鼠炎症相关因子的调控情况,包括si RNA敲低Pint和外源性质粒过表达Pint对炎症相关因子表达的影响。10.RIP检测小鼠巨噬细胞中Pint相互作用的蛋白,包括p65和Ezh2。Co IP检测p65和Ezh2的相互作用。11.构建了DSS诱导的小鼠肠炎模型,定量PCR检测模型小鼠肠组织内Pint的表达情况。收集了来自炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）患者肠组织活检样本,定量PCR检测PINT的表达情况。结果:1.本研究发现lnc RNA PINT是一条依赖于TLR4/NF-κB信号通路的lnc RNA。巨噬细胞和肠上皮细胞系中,PINT表达能被LPS诱导,NF-κB通路抑制剂SC-514可以阻断LPS对PINT表达的诱导。2.荧光素酶报告实验和Ch IP-PCR结果显示NF-κB通过p65识别PINT上游-356--347处的κB结合位点,对其进行转录调控。3.二代测序技术和一系列基因敲除和过表达实验显示PINT、EZH2、p65在转录水平协同调控某些炎症相关因子的表达,即通过炎症相关因子启动子κB位点,影响其转录,如TNF-α。4.RNA-pulldown、Co IP、RNA-FISH实验显示PINT作为支架分子连接p65和EZH2.5.RT-PCR、RNA-FISH、RIP、Co IP实验显示小鼠同源lnc RNA Pint同样受到TLR4/NF-κB信号通路,并可以结合p65和EZH2,调控下游某些炎症因子表达。6.PINT在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）患者肠组织活检样本中出现高表达,以及Pint在DSS肠炎模型小鼠的肠组织中也呈现高表达。结论:PINT作为支架分子连接p65和EZH2,调控TLR4/NF-κB下游某些重要炎症因子的表达,作为固有免疫的精细调控因子发挥功能。本研究揭示了PINT在固有免疫中的重要作用,为免疫相关疾病的治疗提供了新的理论依据和新的靶点。