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癌症是危害人类健康的重大疾病之一,攻克癌症是生命科学研究面临的最大挑战,设计合成高选择性、高效、低毒副作用的新型抗癌药物一直以来都是药物研发领域的前沿和热点。近年来,由于金属钌特有的配位化学性质,特别是其高配位数能为药物研发提供化学多样性、结构多样性的设计基础,以及钌配合物具有的低毒性、易被肿瘤组织吸收、代谢速度快等特点,因此,钌类配合物在抗癌药物设计领域得到愈来愈多的关注。目前为止,已有两种钌基抗癌化合物完成一期临床试验。由于与目前临床使用的铂类金属抗癌药物具有明显不同的作用机制和抗肿瘤谱,钌基配合物有可能成为最有临床应用前景的抗癌药物之一。与此同时,药物的快速筛选在新药设计和研发中发挥着越来越重要的作用,引起人们的广泛关注。特别是计算机虚拟筛选技术在先导化合物的发现中起着不可或缺的关键作用。基于分子对接的虚拟筛选是创新药物研究的新方法和新技术,已成为一种与高通量实验筛选互补的方法,广泛应用于先导化合物的筛选和发现中。
通过设计合成不同的配体,本论文设计合成了一系列Ru(Ⅱ)和Ru(Ⅲ)的DMSO类配合物,并在分子和细胞水平上,对合成化合物的蛋白激酶抑制活性和肿瘤细胞增殖抑制活性进行了筛选(包括实验筛选和计算机虚拟筛选)。主要研究内容包括如下三个部分:
一、设计和合成了5个蛋白酪氨酸激酶-表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂易瑞沙(iressa)的类似物。并以此为配体,设计、合成和表征了9个新型钌基多靶点抗肿瘤化合物。其中,获得2个Iressa类似物和一个钌基配合物的单晶,对它们的晶体结构进行了解析,为后续EGFR抑制剂的虚拟筛选和分子对接分析打下了基础。
二、应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对合成的易瑞沙(Iressa)类似物及其钌基配合物的EGFR抑制活性进行快速筛选,并定量测定了5种初筛活性较好的抑制剂化合物的IC50值。然后,应用Syby1软件的Surflex-docking模块,将这些Iressa类似物和配合物对接到EGFR的活性口袋部位,获得它们的对接分值,预测各个化合物的抑制活性;将预测结果与ELISA实验结果进行比较,分析抑制剂与EGFR间的相互作用模型,从理论上阐明了Iressa衍生物及其配合物抑制EGFR活性的关键结构因素。此外,我们选取了10种化合物,通过硫丹明B(SRB)染色法考察其对人乳腺癌细胞株MCF-7/S及其耐药细胞株MCF-7/A,人非小细胞肺癌细胞株A549,人前列腺癌细胞株PC-3以及人角质形成细胞株Colo-16的生长抑制活性。结果表明,所合成的一种钌基配合物对MCF-7/S在表皮生长因子(EGF)刺激下的细胞增殖具有选择性的抑制活性,证明了我们单分予多靶点金属抗肿瘤药物设计思路的正确性和可行性。
三、结合自制的磁性TiO2空心微球颗粒(TiO2/MHMSS)分离富集蛋白激酶的磷酸化肽底物,发展了一种快速、灵敏、低成本的磷酸化肽MALDI-TOF MS定量分析方法,实现了蛋白酪氨酸激酶EGFR的小分子抑制剂的快速筛选。该方法用于蛋白激酶抑制剂的快速筛选及IC50值的测定,避免了使用昂贵的生化试剂,如单克隆抗体,放射性同位素标记的ATP等,降低了实验成本。此外,我们设计合成了非同位素标记的磷酸化肽段作为内标,该肽段在选定的实验条件下与磷酸化底物具有相似的质谱响应,为磷酸化肽的MS定量测定奠定了基础,进一步降低了实验成本。与ELISA测定的结果比较表明,发展和建立的TiO2/MHMSS富集分离-MALDI-MS联用方法是一种高灵敏、低成本、操作简单的蛋白激酶抑制剂快速筛选方法。