研究背景与目的中国细菌耐药监测网(CHINET)从2005年到2013年连续八年对全国各地临床分离菌株进行耐药性检测,分析结果表明,革兰阴性杆菌为我国大型教学医院主要的临床分离菌株(约占70%),分离率有升高趋势,从2005年为66.9%至2010年的71.6%,在2013年升至73.0%。其中肠杆菌科耐碳青霉烯药物比例从2005年0%~3%升至2013年的7%,非发酵菌耐碳青霉烯药物比例从2005年30%升至2013年的60%。革兰阴性菌中最常见的菌株分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌。二十世纪八十年代以来,由于广谱抗菌药物的滥用,革兰阴性杆菌的耐药状况日趋严重。基于碳青霉烯类药物对革兰阴性杆菌具有稳定的抗菌效果,临床将其作为对革兰阴性杆菌感染治疗的重要手段。然而,近年来,对碳青霉烯药物耐药细菌的报道越来越多。因此,加强对此类细菌耐药性的研究、监测、遏制耐碳青霉烯类药物菌株的产生与传播,成为微生物领域的研究热点。耐碳青霉烯类药物革兰阴性杆菌常常为多重耐药/泛耐药菌株,携带并有效表达耐药基因,是此类菌株产生耐药的分子机制,产生水解酶,通道蛋白改变,外排泵过表达,青霉素结合蛋白改变等,是细菌对药物产生耐药性的关键机制。目前用于治疗此类菌株感染的抗菌药物主要为β内酰胺类药物,包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类药物等。菌株对这些药物的耐药常常涉及一种或多种机制。鉴于临床治疗实际需要及检测试验可操作性等原因,明确此类菌株的耐药表型,是当前研究的主要内容之一。根据体外药物敏感试验结果,分析临床分离菌株对各类药物的耐药特征,可有效反映分离菌株耐药性的地域性差异,对于指导当地临床医生合理抗菌治疗具有重要的实践价值。对于碳青霉烯类药物而言,产生碳青霉烯酶是细菌耐药的主要机制。目前,国内外针对此类菌株的研究,多着力于碳青霉烯酶在不同菌株中的分布差异,以及在不同地域的流行分布特征。根据Ambler分子结构分类,可将碳青霉烯酶分为3组,分别为A、B、D三类酶,A类、D类为丝氨酸酶,B类为金属beta内酰胺酶。B类酶中又以NDM-1型酶最为常见,在世界多个国家和地区均有报道,并且blaNDM的变异基因正在逐渐发现并报道(包括NDM-1到NDM-14)。研究表明,亚型之间虽然仅有个别氨基酸的置换,但其耐药性有所不同。此外,从生物信息学的角度来看,不同型别的碳青霉烯酶受到抗菌药物长期作用,有着各自相对稳定的进化关系。明确本地区所流行碳青霉烯酶的种类,以及不同菌株中携带酶的类型差异,分析流行型别在进化关系树中的位置,预测其下一步可能的突变进化方向,对指导本地区抗感染治疗,具有重要意义。基于耐碳青霉烯革兰阴性杆菌的广泛耐药活性,此类菌株在院内感染中占据着重要地位,而院内感染又是此类菌株扩散及其耐药性在菌株间传播的重要方式。因此,对临床分离菌株进行克隆株分型研究,明确是否存在耐碳青霉烯药物菌株,以及该菌株是否有院内感染流行趋势,可为临床经验治疗提供合理指导外,对于院内感染的防控亦具有重要价值。为解决上述问题,我们设计了本课题,旨在通过检测临床分离耐碳青霉烯革兰阴性杆菌,分析其耐药表型,探究碳青霉烯耐药基因的存在与分布,明确是否有院内感染的存在,为临床抗感染治疗及流行病学研究,提供可靠的实验室依据。研究方法(1)菌株收集收集郑州大学第一附属医院检验科细菌室2013年7月到2013年12月份间,临床分离来自河南不同地区的不同标本来源的耐亚胺培南/美罗培南非重复革兰阴性杆菌121株,其中大肠埃希菌10株,肺炎克雷伯菌19株,铜绿假单胞菌30株和鲍曼不动杆菌62株所有菌株均经过Vitek 2 Compact鉴定到种。(2)细菌耐药性及流行病学分析采用WHOnet5.0分析软件,对所有分离菌株流行分布特征及耐药表型进行统计分析。药物敏感试验质控菌株采用大肠埃希菌ATCC 25922。(3)全基因组DNA采用DNA提取试剂盒提取。严格按照说明书要求规范操作。(4)耐碳青霉烯菌株初筛首先用改良Hodge实验和EDTA协同抑制实验对碳青霉烯酶进行表型筛选,改良Hodge实验以待测株和阳性对照株在抑菌圈与划线交叉处有增强生长现象为筛选阳性。EDTA协同实验以靠近EDTA纸片处有抑菌环扩大为阳性筛选。(5)耐碳青霉烯菌株确证对于初筛阳性菌株,提取全基因组DNA后,采用PCR技术对A类(KPC)、B类(NDM,VIM,SPM,IMP,GIM)和D类酶基因(OXA23,OXA24,OXA51,OXA58)扩增,并对扩增产物进行测序分析,测序结果Blast比对明确型别。(6)分子进化预测分析NDM酶所有变异体结构及氨基酸序列差异,使用软件分析药物正选择位点并模拟变异体酶蛋白三维结构,进行NDM变异体同源性分析。(7)菌株分型研究采用RAPD-PCR方法对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌进行随机引物扩增,依据扩增结果对菌株进行同源性分析。研究结果1碳青霉烯酶检出情况检出A类KPC阳性11株,其中肺炎克雷伯菌10株,大肠埃希菌1株,检出B类NDM阳性7株,其中肺炎克雷伯菌3株,大肠埃希菌4株,其中有两株检测出NDM-5(国内仅两例报道)。对铜绿假单胞菌的碳青霉烯酶基因扩增,结果均为阴性,鲍曼不动杆菌对D类酶基因扩增,60株鲍曼均为OXA23,OXA51阳性,其中一株鲍曼不动OXA24阳性,一株OXA58阳性。2金属酶NDM变异体本研究通过对PCR阳性标本的测序中发现了blaNDM-5,发现时国内尚无报道,仅在国际上有几例报道。blaNDM-5相比于blaNDM-1为88位与154位发生氨基酸置换。3菌株分型情况根据RAPD-PCR菌株分型技术联合琼脂糖凝胶电泳,将铜绿假单胞菌分为14型,鲍曼不动杆菌分为4型。结论(1)肠杆菌科碳青霉烯酶基因分离率高,占62%,产生碳青霉烯酶是肠杆菌科耐碳青霉烯药物的主要机制。其中在两株大肠埃希菌中发现blaNDM-1变异基因blaNDM-5,并且耐药性不同。耐药基因通过单个核苷酸的突变产生新的耐药基因型。(2)在铜绿假单胞菌中未发现碳青霉烯酶基因,并且对通道蛋白基因检测均为阴性,可推测此地铜绿假单胞菌耐碳青霉烯药物机制以通道蛋白缺失为主。(3)铜绿假单胞菌的RAPD-PCR结果,分为14型,鲍曼不动杆菌分型结果为4型,其中一型占88.7%,铜绿假单胞菌主要以散发为主,鲍曼不动杆菌有明显优势克隆株,应加强监测,防止优势克隆株的流行。