论文部分内容阅读
目的:构建稳定的沙门氏菌表达载体,在此基础上构建鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株并研究其稳定性。体外建立鼠伤寒沙门氏菌感染Henle-407的细胞模型,观察沙门菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvC致病机制提供理论和实验依据,并为后续利用动物模型进行该基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因荧光回补株的构建及其稳定性的研究。以低拷贝克隆载体pACYC-184为基础,根据GenBank数据库中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter启动子,下游增加rrnB ribosomal终止子,两端位点上、下游序列设计相应酶切位点,采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP载体,并依次调取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,构建得到pACYC184-eGFP-HOK载体、pACYC184-spvB-eGFP-HOK载体及pACYC184-spvC-eGFP-HOK载体,分别电转化入对应的鼠伤寒沙门氏菌spv基因缺陷变异株得到相应的回补株,并对质粒的稳定性及荧光蛋白表达情况进行检测。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。携带spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠伤寒沙门氏菌211、敲除spvC的缺陷变异株(ST211-△-e-spvC)及回补株(ST211-c-spvC)与Henle-407细胞共培养,取不同干预时间点的细胞进行实验。荧光显微镜观察细胞核形态学改变和胞内菌数量;Promega荧光素酶发光法检测Caspase3/7活性;Western blot法检测ERK和p-ERK表达水平;胞内集落形成单位的检测采用平板菌落计法。结果:一、鼠伤寒沙门氏菌spv基因回补株的构建及其稳定性的研究。1.经PCR及基因测序证实成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因荧光回补株。2.含有低拷贝质粒的回补株在连续培养12代或144h都未发生丢失,在细菌感染细胞模型中用荧光显微镜可观察到细菌带绿色荧光。二、沙门氏菌质粒毒力基因spvC对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响及其分子机制的研究。1.荧光显微镜下ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞在4h出现大量的细胞核呈波纹状或折缝样、部分染色质凝聚等早期细胞凋亡形态学改变,而ST211-△-e-spvC感染组及空白对照组无明显凋亡形态学改变。感染24h,ST211感染组与ST211-c-spvC感染组细胞的染色质高度凝聚边缘化、产生凋亡小体并出现大量以坏死为特征的形态学改变,ST211-△-e-spvC仅部分细胞存在凋亡、坏死形态学改变。2.Caspase-3/7活性检测结果显示,各组Caspase-3/7活性随感染时间的延长而升高,0h和4h,三个感染组间的Fluorescence值无明显差异(P>0.05);感染后4h,细菌感染组较空白对照组出现显著差异(P<0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染组较ST211-eGFP感染组和ST211-c-spvC感染组的Fluorescence值有差异(P<0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分别为(24h;空白对照组,0.89±0.03;ST211-eGFP感染组,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染组,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染组,0.11±0.04),ST211-eGFP感染组与ST211-c-spv C感染组的p-ERK蛋白的比值较ST211-△-e-spvC感染组显著降低(P<0.01)。4.共培养的前4h,组间胞内活菌数无明显差异(P>0.05)。在干预后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染组与ST211-c-spvC感染组胞内活菌数高于ST211-△-e-spvC感染组(P<0.05)。结论:1.高度稳定且含有绿色荧光蛋白标签的沙门氏菌表达载体及spv基因回补株构建成功,为深入研究鼠伤寒沙门菌毒力基因的功能奠定了基础。2.沙门菌质粒毒力基因spvC可通过诱导细胞凋亡促进细菌在宿主细胞内的存活和增殖,进而加重细胞损伤,这一作用可能与其影响ERK的磷酸化水平有关。