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目的:1、通过检测线粒体肌病/脑肌病的线粒体DNA(mtDNA)突变情况,探讨线粒体肌病/脑肌病的基因型与临床表型的关系。2、建立和完善实时荧光定量PCR结合突变阻滞形成系统( RT ARMS-qPCR)技术,用于检测线粒体DNA A3243G突变负荷,并探讨线粒体肌病/脑肌病患者不同组织中突变负荷的分布情况。方法:1、采用聚合酶连反应结合限制性酶切分析(PCR-RFLP)及测序等技术对45例临床诊断或疑诊线粒体肌病/脑肌病的mtDNA A3302G、A3243G、T3271C、G3460A、A8344G、T8356C、T8993G、G11778A、T14484C、G15257A等突变热点进行筛查,分析突变阳性患者的临床特点。2、分别构建含线粒体DNA3243位点的野生型(A)和突变型(G)序列的质粒,将这两种质粒按一定比例混合构建成13个含有不同A3243G突变负荷的标准对照,应用PCR-限制性片断多态性技术(RFLP)和RT ARMS-qPCR技术检测13个标准对照及存在A3243G突变的患者及携带者的外周血、肌肉、毛发及尿沉渣等组织的A3243G突变负荷。3、用PCR结合测序的方法对3例临床确诊而无热点突变的线粒体肌病/脑肌病患者的骨骼肌全长mtDNA进行序列分析。结果:1、45例临床诊断或疑诊线粒体肌病/脑肌病患者中8例A3243G异质性突变阳性,占全部患者的17.78%,均表现为MELAS,且同一患者的肌肉组织、头发、尿沉渣等组织的A3243G突变型比例(突变负荷)较外周血高。2、45例拟诊线粒体肌病/脑肌病患者均无A3302G、T3271C、G3460A、A8344G、T8356C、T8993G、G11778A、T14484C、G15257A等热点突变。3、PCR-RFLP和RT ARMS-qPCR检测含有不同A3243G突变负荷的标准对照经的突变负荷均与预期值呈直线相关,决定系数分别为R12=0.885、R22=0.991,RT ARMS-qPCR检测的结果更接近预期值;RT ARMS-qPCR检测A3243G突变阳性患者及携带者的突变负荷比经PCR-RFLP检测的高,且RT ARMS-qPCR比PCR-RFLP更容易检测出低负荷的A3243G突变,定量检测的结果显示MELAS患者的肌肉、尿沉渣、头发的A3243G突变负荷均高于外周血。4、3例临床确诊而无热点突变的线粒体肌病/脑肌病患者经mtDNA全长测序,共发现一个异质性变异C5961T,5个同质性变异A14071G、C14632T、T1520C、G7600A、G7604A,120例对照均无上述变异。结论:1、mtDNA上的A3243G突变是我国线粒体肌病/脑肌病最常见的突变,基因检测可以协助临床诊断。2、应用RT ARMS-qPCR可以快速、灵敏、准确地检测不同组织的A3243G突变及其突变负荷。3、异质性突变的突变负荷在不同组织的分布不同,肌肉、尿液和毛发等组织较外周血高,尿液和毛发等经无创伤即可获得的组织可用于检测突变。4、异质性突变C5691T很可能是MERRF的一种新的致病性突变,同质性T1520C可能是与线粒体肌病/脑肌病相关的多态,G7600A、G7604A、A14071G、C14632T等同质性变异可能是未报道多态。