南海石头鱼毒素的分离纯化、毒性测定、分子克隆及原核表达研究

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石头鱼生活在印度洋和太平洋的热带及亚热带浅水区域,是世界上毒性最强的鱼。其毒液可以引起一系列中毒症状,如剧痛、水肿、肌肉麻痹、低血压等。目前已在石头鱼粗毒液中分离出毒素neoVTX。中国海域的石头鱼为玫瑰毒鲉,主要分布于南海海域。目的:获得南海石头鱼毒素的毒性状况、组分的蛋白质序列及蛋白质表达方法,为其抗毒素的制备及石头鱼刺伤的防治奠定基础。方法:提取南海石头鱼的粗毒液,利用SDS-PAGE及MS鉴定粗毒液的主要成分,再用GF-HPLC小量分离粗毒液的主要成分,然后用AKTA蛋白质分离系统对粗毒液进行大量分离,并测定粗毒液及其分离组分的LD50;分离石头鱼毒囊组织,提取石头鱼毒囊RNA,运用RACE技术,获得毒素的cDNA全序列,连入pET-22b(+)中,进行原核表达。结果:1.在粗毒液的电泳条带中,发现了2个已知蛋白质和4个未知蛋白质。其中2个已知蛋白质被鉴定为已报道的neoVTX α、β亚基;4个未知蛋白质中,有2个蛋白质与已报道的neoVTX β条带有最高匹配度;另有2个分别与β微管蛋白,3-磷酸甘油醛脱氢酶匹配度最高;2.对粗毒液进行GF-HPLC分离后,发现了5种尚未报道的分子量约为14KD的小分子蛋白质;3.粗毒液对小鼠的LD50(i.v.)为106ng/g, neoVTX对小鼠的LD50(i.v.)为66ng/g,分子量约为14KD的小分子蛋白质在278ng/g时,对小鼠完全没有中毒症状及致死性;4.成功克隆了neoVTX α和β亚基的cDNA序列,与冲绳海域玫瑰毒鲉的neoVTX α和β的cDNA序列均具有高达99%的序列同源性;5.以pET-22b(+)为表达载体,Rosetta感受态细胞为宿主,对neoVTX α和β亚基进行原核表达,成功表达了neoVTX α,产率为0.45mg/L;β亚基未能成功表达。结论:1.玫瑰毒鲉粗毒液的成分除neoVTX外,还有至少3类蛋白质:第1类是与neoVTX β有较高匹配度的蛋白质,推测为分子量较小的毒素或neoVTX β的降解片段;第2类推测为石头鱼的结构蛋白及代谢酶;第3类为多种分子量约为14KD的蛋白质;2.分子量约为14KD的蛋白质对小鼠未表现出毒性,表明它们并非毒性成分;3.首次探索到neoVTX α亚基的表达工艺。
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