目的:1.研究差异表达microRNA与冠心病气虚血瘀证、气虚痰瘀证的关系,主要在于发现冠心病上述两证型的特异性miRNA,并初步了解冠心病两证型特异性miRNA的调控机理,为冠心病辨证分型提供客观化依据,推动冠心病证候诊断的客观化和规范化建设。2.探讨中医辩证治疗后,特异microRNA与相关证型的动态演变关系,更进一步的揭示中医证候的本质,同时从microRNA层面积极寻找中医治疗的新靶点,为中医治疗冠心病的相关机制做了新的探索,丰富现代中医理论的内涵。方法:1.差异表达谱的筛选:招募2名冠心病气虚血瘀证、2名冠心病气虚痰瘀证和1名健康志愿者,采集外周血,并用microRNA血清试剂盒提取microRNA,运用高通量测序平台检测正常人外周血与冠心病气虚血瘀、气虚痰瘀患者外周血中miRNA表达谱,分析差异表达的miRNA。通过miRanda-3.3a预测靶基因,另外基于miranda数据库,以功能富集分析的方法对靶基因进行注释,同时进行差异miRNA的KEGG通路分析。2.采用实时荧光定量PCR方法验证部分差异miRNA:10名冠心病气虚血瘀证患者,14名冠心病气虚痰瘀证患者,5名健康志愿者分别采集外周血,运用qRT-PCR方法验证高通量测序的miRNA结果,分析miRNA表达差异及意义。3.中医辩证治疗与特异microRNA的动态演变关系(通冠胶囊对冠心病气虚血瘀证患者microRNA的影响):将纳入的冠心病气虚血瘀证患者20例随机分为治疗组和对照组,每组各10例。对照组使用冠心病常规西医治疗,治疗组在对照组治疗的基础上,加通冠胶囊干预,另招募15名健康志愿者,于治疗前和治疗后1个月运用qRTPCR检测血清miR-17-5p.miR-320c表达水平。结果:1.高通量测序构建冠心病ACS气虚痰瘀与气虚血瘀的差异microRNA表达谱。(1)气虚血瘀证组和正常组比较,共筛选出127条差异表达的microRNA,0条上调,127条下调(P<0.05)。其中,具有显著性差异的microRNA共46条(P<0.01)主要下调的基因有miR-17-5P、miR-320a、miR-320c等。(2)气虚痰瘀证组和正常组比较,共筛选出72条差异表达的microRNA,0条上调,72条下调(P<0.05)。其中具有显著性差异的microRNA共有39条(P<O.O1),主要下调基因有miR-4433-3P、miR-363-5P等。(3)气虚血瘀组和气虚痰瘀组比较,共筛选出4条差异表达microRNA(P<O.O5),其中上调0条,下调的4条,可得出冠心病ACS气虚血瘀证与气虚痰瘀证的差异microRNA表达谱为miR-17-5P、miR-320a、miR-320c、miR-320d。(4)气虚血瘀与气虚痰瘀靶基因预测(1)气虚血瘀组与健康志愿者组比较,共筛选出8597条差异microRNA靶基因,并对相应靶基因进行CO功能分析,差异miRNA所靶向的基因的CO功能分析主要体现在生物过程部分、细胞组分和元件部分和分子功能部分,而在生物过程部分中细胞、代谢、单有机体生物过程是最主要的,细胞及细胞部分(cell,cell apart)功能在细胞组分和元件中所占比例较多,最后在分子功能中靶基因富集的功能最集中在结合(binding)以及催化过程。(2)气虚痰瘀组与健康志愿者组比较,将筛选出的差异microRNA进行靶基因预测,共得出靶基因9832条,并对相应靶基因进行CO功能分析,差异miRNA所靶向的基因的CO功能分析主要体现在生物过程部分、细胞组分和元件部分和分子功能部分,而在生物过程部分中细胞、代谢过程是最主要的,细胞及细胞部分(cell,cell apart)功能在细胞组分和元件中所占比例较多,最后在分子功能中靶基因富集的功能最集中在结合(binding)以及催化过程。(5)气虚血瘀与气虚痰瘀靶基因KEGG通路分析(1)气虚血瘀组差异表达的miRNA基因富集的KEGG通路。冠心病气虚血瘀患者和健康人相比,差异mirna靶基因经过KEGG通路的富集性分析,发现与冠心病关系密切的通路有MAPK信号通路、钙信号通路。(2)气虚痰瘀组差异表达的miRNA基因富集的KEGG通路。冠心病气虚痰瘀患者和健康人相比,差异mirna靶基因经过KEGG通路的富集性分析,发现与冠心病关系有密切的通路有T细胞受体信号通路、wnT信号通路,MAPK信号通路、钙信号通路。2.qPCR验证(1)气虚血瘀证组和健康对照组比较:经qRT-PCR验证分析发现,与健康对照组相比,ACS气虚血瘀证组中的miR-320a正常组未扩增出,可能与基因拷贝数太低有关,miR-320c、miR-17-5P的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)(2)气虚痰瘀证组和健康对照组比较:经qRT-PCR验证分析发现,与健康对照组相比,气虚痰瘀组中miR-668、miR-320d的表达下调,差异有统计学意义,(P<0.05),miR-363-5P、miR-4284表达下调,但统计无差异,miR-4433-3P因某些片段基因外参数较低而未能进行表达量的比较。(3)经qRT-PCR验证分析发现,ACS气虚血瘀证组和气虚痰瘀患者血浆中有2个共同miRNAs,即miR-320c、miR-320d;它们在两证型中都下调,但两者无统计学差异。3.中医辩证治疗与相关证型特异microRNA关系(通冠胶囊对冠心病气虚血瘀证患者microRNA影响)。与正常人比较,冠心病气虚血瘀证miR-320c表达降低。通冠胶囊治疗后,治疗组与对照组两组miR-320c表达水平较治疗前均有升高,但治疗组miR-320c表达水平较治疗前显著升高(P=0.013<0.05);对照组,治疗前后miR-320c表达水平比较无统计学差异(P=0.22>0.05);与正常人相比,冠心病气虚血瘀证miR-17-5P表达降低,治疗后,治疗组与对照组miR-17-5P表达水平较治疗前均有升高而治疗组miR-17-5P表达水平较治疗前显著升高(P=0.016<0.05);对照组,治疗前后miR-17-5P表达水平比较无统计学差异(P=0.34>0.05)。结论:1.冠心病气虚血瘀证相关特异性microRNA为miR-320c、miR-17-5P,气虚血瘀组与健康志愿者组比较,共筛选出8597条差异microRNA靶基因,并对相应靶基因进行CO功能分析,差异miRNA所靶向的基因的CO功能分析主要体现在生物过程部分、细胞组分和元件部分和分子功能部分,而在生物过程部分中细胞、代谢、单有机体生物过程是最主要的,细胞及细胞部分(cell,cell apart)功能在细胞组分和元件中所占比例较多,最后在分子功能中靶基因富集的功能最集中在结合(binding)以及催化过程。主要靶基因KEGG通路为MAPK信号通路、钙信号通路。2.冠心病气虚痰瘀证相关特异性microRNA为miR-668、miR-320d,气虚痰瘀组与健康志愿者组比较,将筛选出的差异microRNA进行靶基因预测,共得出靶基因9832条,并对相应靶基因进行CO功能分析,差异miRNA所靶向的基因的CO功能分析主要体现在生物过程部分、细胞组分和元件部分和分子功能部分,而在生物过程部分中细胞、代谢过程是最主要的,细胞及细胞部分(cell,cell apart)功能在细胞组分和元件中所占比例较多,最后在分子功能中靶基因富集的功能最集中在结合(binding)以及催化过程。主要靶基因KEGG通路为T细胞受体信号通路、wnT信号通路,MAPK信号通路、钙信号通路。3.冠心病气虚血瘀证与气虚痰瘀证共同miRNA为miR-320c、miR-320d;它们表达较正常组出现差异,且在两证型间表达无差异,考虑影响了ACS共有的病理生理过程的调控,在ACS致病机制中发挥重要作用,可以作为ACS潜在的生物学标志物进一步深入研究。4.miR-320c、miR-17-5P与通冠胶囊干预后冠心病气虚血瘀证患者的病情演变相关,进一步证明了miR-320c、miR-17-5P可作为冠心病气虚血瘀证的潜在生物学标志物,同时为探讨通冠胶囊治疗冠心病的作用靶点及机制奠定研究基础。