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目的:
三氯乙烯 (trichloroethylene,TCE) 是一种挥发性的脂溶性小分子有机化合物,在工业上常用做金属去污剂、干洗剂、溶剂等,而且其应用呈上升趋势。TCE在生产和使用过程中 TCE主要经呼吸道和皮肤进入体内,TCE除可导致心脏、肝、肾和神经系统损伤外,还可导致明显的皮肤损害,主要表现为职业性皮炎,原发性刺激、脱脂等。近年来 TCE接触工人药疹样皮炎的发病率不断上升,发病以皮肤过敏症状为主要表现,其发生的确切机理目前尚不清楚,推测可能为TCE或其代谢产物所致的过敏性接触性皮炎,与参与机体免疫应答的免疫因子(如IL-10等)有关。IL-10主要由单核巨噬细胞产生,是强有力的抗炎因子,可通过抑制多种活化的单核细胞产生免疫因子发挥其抗炎活性,IL-10能抑制共刺激的表达,下调和抑制前炎症性细胞因子的活性,因此本研究在建立了TCE致皮肤过敏的豚鼠动物模型的基础上研究豚鼠在TCE致敏后皮肤炎症的变化及相关免疫因子IL-10表达水平,为进一步探索TCE致过敏性皮炎的免疫学机制奠定理论基础。
方法:
1、三氯乙烯皮肤染毒豚鼠药疹性皮炎动物模型的建立:按《OECD Guideline fortesting of chemicals》(No.406)皮肤变态反应试验豚鼠最大值法进行试验。实验用豚鼠随机分成实验组(14只)、阴性对照组(8只)及阳性对照组(8只),每组动物雌雄各半。在正式实验的第1d和第8d各进行1次致敏接触,在第21d进行激发。于激发后48h观察和记录各组动物皮肤反应情况,随后麻醉动物,采血分离血清并摘除豚鼠脾脏,用于测定IL-10含量。剪取皮肤组织一部分用于病理组织学观察,另一部分存放液氮罐,用于RT-PCR检测。
2、脾组织匀浆及血清中IL-10测定:三组实验动物采取心脏放血收集血液。然后在无菌环境下取出脾。所有全血进行低温离心取血清。脾组织用匀浆器以磷酸缓冲液为匀浆介质制备10%脾组织匀浆,离心,取上清液测定IL-10水平。检测方法采用ELISA法,按照豚鼠IL-10(通用型)试剂盒说明操作。
3、各组动物皮肤组织总RNA的提取:按TRIzol试剂盒说明书对组织进行总RNA的提取,总RNA经无RNA酶处理以去除可能污染的DNA,之后在核酸定量仪下测定其浓度和纯度,并取5ul总RNA于2%琼脂糖凝胶电泳后,于紫外线分析仪下检测总RNA的完整性。
4、各组动物皮肤组织中IL-10mRNA水平的测定:通过对实验组、阳性对照组、阴性对照组染毒动物皮肤进行总RNA的抽提,用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法,以β-actin作为内参照半定量检测IL-10基因mRNA表达水平。
结果:
1.三氯乙烯皮肤染毒豚鼠药疹性皮炎动物模型
1.1 皮肤致敏反应阳性对照组8只动物均出现经斑及水肿反应,致敏率为100%;实验组14只动物中有9只出现红斑,其中6只动物表现出轻微的水肿,其余3只红斑与水肿程度均低于阳性对照组,致敏率为64.29%。阴性对照组皮肤未见异常。
1.2 病理组织学检查实验组动物棘层明显增厚,棘细胞内水肿较普遍,真皮内毛细血管扩张、水肿,单核细胞浸润,变应性明显。阳性对照组动物角质层、粒细胞层中炎症细胞浸润,粒细胞轻度肿胀,基底层细胞未见异常,真皮层也有散在炎症细胞浸润管扩张,水肿。阴性对照组角质层角化完全,棘层无增厚,真皮内未见毛细管扩张、水肿和炎症细胞浸润。
2.脾组织匀浆和血清中IL-10水平测定
2.1 脾组织匀浆中IL-10水平测定实验组(n=14)IL-10水平测定结果为241.1±51.79(x±s pg/mL),阳性对照组(n=8)IL-10水平为159.5±5.28(x±s pg/mL),阴性对照组(n=8)IL-10水平为52.34±3.14(x±spg/mL)。实验组IL-10水平与阴性对照组IL-10水平相比,差异具有显著性(P<0.01)。
2.2 血清中IL-10水平测定实验组(n=14) IL-10水平测定结果为32.7±5.48(x±s pg/mL),阳性实验组(n=8)IL-10水平11.7±5.55(x±s pg/mL),阴性对照组(n=8)IL-10水平5.32±3.20(x±spg/mL)。实验组与阴性对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)。
3.皮肤组织中总RNA的完整性及纯度分析从各组动物的皮肤组织中提取总RNA,并在核酸蛋白定量仪上进行检测,其OD260/OD280值均在1.9~2.0之间,表明总RNA较纯,琼脂糖凝胶电泳结果显示28S及18S条带清晰,且28S条带的亮度是18S的2倍,5S条带未见或隐约可见,表明总RNA完整无降解,可用于进一步定量测量。
4.RT-PCR测定皮肤组织中IL-10 mRNA表达水平抽提待检皮肤组织总RNA,经两步法RT-PCR扩增后,获得IL-10 cDNA扩增片段。用琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR产物,并用凝胶成像系统扫描IL-10和β-Actin电泳条带,结果显示与阴性对照组相比,实验组和阳性对照组IL-10基因mRNA表达水平有不同程度的升高。
结论:
1.用三氯乙烯反复免疫刺激实验豚鼠,可诱导豚鼠发生迟发性过敏性反应。
2.三氯乙烯能使实验动物血清及脾组织中IL-10表达水平升高,三氯乙烯能使实验动物皮肤组织中IL-10mRNA表达水平增高。
3.IL-10与三氯乙烯所致的皮肤炎症密切相关,可能在下调节局部炎症起重要作用可以作为病情检测的指标之一。