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黄瓜(cucumis sativus L.)又名胡瓜、王瓜,原产于印度北部,喜马拉雅山脉的库曼、锡金一带,是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属的一个栽培种。黄瓜性喜温暖、不耐寒冷,生长发育最适温度为25-30℃,高温胁迫的温度界限为30℃,超过35℃植株生长停滞,50℃作用1h则呼吸停止,60℃仅5-6min就会导致植株枯死。黄瓜具有营养丰富、品种多、产量高、供应期长等特点,不仅露地的栽培面积大,而且1990年以来保护地的生产也迅速发展,是我国南北方在栽培面积上仅次于番茄的重要果菜之一。但是,露地和保护地栽培中的高温胁迫极易给黄瓜生产造成较大损失,这种损失在长江流域及其以南地区尤为严重。培育耐高温的优良品种是解决这一问题的根本途径,然而,黄瓜种内缺乏耐热的品种和资源材料。弄清黄瓜耐热、不耐热或热激反应的分子机制,对于生理调节或分子改良黄瓜耐热性具有重要价值。 热激因子结合蛋白(HSBP)是一类高度保守的、结构特殊的蛋白家族,它参与生物体热激蛋白基因表达的调控过程,对热激蛋白基因的表达起负调控作用。本研究克隆了黄瓜热激因子结合蛋白1(CsHSBP1)基因,Southern杂交分析了基因拷贝数,RT-PCR分析了表达情况,并对该基因及其推导的氨基酸序列和结构进行了分析,为今后深入研究该基因在黄瓜热激反应中的作用奠定了基础。 1 CsHSBP1基因的克隆 将-80℃保存的黄瓜幼果cDNA原始文库感染宿主细胞XL1-Blue后倒平板,37℃培养获得噬菌斑。挑取单个噬菌斑于裂解液中裂解出λ噬菌体,感染宿主细胞BM25.8后31℃培养进行亚克隆。随机选取分离良好的白色菌斑进行菌落PCR筛选,初步确定为阳性克隆后提取质粒,检测质粒大小并通过质粒PCR确定插入片段大小。委托上海鼎安生物技术公司从cDNA的5’端进行测序。通过EST序列分析,发现了与热激反应相关的HSBP1基因,命名为CsHSBP1。 根据获得的CsHSBP1基因序列设计PCR引物,采用pfu高保真DNA聚合酶进行巢式PCR扩增,电泳回收340bp的编码区cDNA片段,Taq DNA聚合酶加“A”尾,采用TA克