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研究背景:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是烧伤病房最常见的分离菌之一,近10年来一直位居西南医院烧伤科细菌分离率前三甲[1]。随着抗菌药物的广泛应用,铜绿假单胞菌的耐药情况越来越严重,尤其是多耐药、广泛耐药铜绿假单胞菌的出现,给临床治疗带来了极大的挑战[2]。虽然铜绿假单胞菌是烧伤病房最常见且耐药率极高的病原菌之一,但目前为止,尚没有中国西南地区烧伤病房铜绿假单胞菌的分子流行病学相关的调查研究结果,也没有对其耐药情况进行详尽系统的分析。西南医院烧伤科作为西南地区最大的烧伤中心,拥有120张床位,每年接收大量来至中国西南地区的烧伤病人,这为我们进行相关研究提供了基础。而对烧伤病房内铜绿假单胞菌的分子流行病学情况及耐药情况进行调查研究,以了解烧伤病房内铜绿假单胞菌的流行传播情况及其遗传背景,有助于更深入的认识铜绿假单胞菌感染的危害性及耐药的严重性,可以针对性的指导感染防控措施的制定以及临床抗菌药物的合理使用。碳青霉烯类药物是抗菌谱广、抗菌活性强的非典型β-内酰胺类药物,具有抗假单胞菌活性强、对β-内酰胺酶稳定以及低毒性等特点,而且与3代头孢菌素无交叉耐药现象,一直是临床治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一,也是临床上治疗烧伤后多耐药铜绿假单胞菌感染的最主要抗菌药物[3]。该药在上市之初对铜绿假单胞菌的敏感性几乎达到了100%,但是随着碳青霉烯类药物在临床的广泛使用,铜绿假单胞菌对其的耐药越来越严重,而这种现象在烧伤病房中更为显著。中国细菌耐药检测网数据显示,2018年23431株铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率为30.7%和25.8%。我科烧伤监护室近3年分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率达到了32.5%,而据Radan等报道,2014年伊朗某烧伤病房分离的150株铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率甚至达到了96%[4]。进行细菌的药敏分析与分子流行病学调查是了解细菌耐药现状、认识细菌遗传特征与流行特征的重要手段。多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）是应用最为广泛的细菌分子分型方法之一,通过MLST可获得的ST（sequence type）型别,后者可用于分析不同细菌的遗传背景与亲缘关系等。同时,不同ST型别在耐药特征等方面也可表现出不同特点,将其与药敏结果相结合进行研究,对于深入认识细菌遗传因素与耐药之间的关系大有裨益。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药率之所以不断上升,离不开其多样且可遗传的耐药机制。敏感铜绿假单胞菌可以通过获得多种碳青霉烯酶基因、基因突变或插入序列插入等致孔蛋白OprD活性抑制或失活、高表达头孢菌素酶AmpC或外排泵MexAB-OprM等变为碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌。深入地了解和研究相关耐药机制,不仅能够指导临床医师制定有效的抗感染方案,防控耐药细菌的播散,而且对新型抗菌药物的研制也具有重要意义。研究目的:1、对西南医院烧伤病房2011年1月至2016年5月间分离鉴定的铜绿假单胞菌的分子流行病学进行调查研究,进而了解烧伤病房铜绿假单胞菌的分子流行病学特征与遗传背景,为制定铜绿假单胞菌感染的防控措施提供依据与帮助。2、系统性的对西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌进行耐药性分析,为临床抗菌药物的使用提供重要参考。3、对碳青霉烯类药物不敏感的铜绿假单胞菌株进行较全面的耐药机制分析,了解铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药机制,为耐药铜绿假单胞菌的防控和的抗菌药物的研发提供理论支撑。研究方法:第一部分西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌分子流行病学及耐药情况调查研究（一）西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌的分子流行病学调查收集西南医院烧伤科2011年1月至2016年5月住院患者创面及血流感染来源的196株铜绿假单胞菌,取患者该感染部位的第一份阳性标本作为研究对象。根据菌株来源将其分为3组:血流感染分离株命名为Bl组（73株）、不伴血流感染的创面分离株命名为WN组（80株）、伴有血流感染的创面分离株命名为WB组（43株）。然后采用MLST法对这些菌株进行分子分型,用BioNumerics（7.6）软件分析不同ST型别之间的克隆关系。（二）西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌药敏情况分析使用K-B琼脂扩散法检测铜绿假单胞菌对以下10种的敏感性,包括哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、奈替米星（NET）、头孢吡肟（FEP）、头孢哌酮/舒巴坦（CSL）、阿米卡星（AMK）、庆大霉素（GEN）、环丙沙星（CIP）、头孢他啶（CAZ）和左氧氟沙星（LVX）。对亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）和多粘菌素B（POL）的药敏试验则采用肉汤稀释法。第二部分西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药机制分析（本部分实验对象为第一部分实验中检测到的碳青霉烯非敏感菌株）（一）碳青霉烯酶基因的检测使用多重PCR扩增11个常见碳青霉烯酶基因(blaIMP、blaVIM、blaNDM、blaGES、bla SPM、blaBIC、blaKPC、blaAIM、blaGIM、blaSIM和blaDIM),扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。（二）孔蛋白oprD基因的检测与突变分析对铜绿假单胞菌的oprD基因进行扩增后测序。将其DNA序列与对照菌株PAO1的oprD序列进行比对,比对软件为MEGA7.0[5]。（三）头孢菌素酶基因ampC及外排泵基因mexB表达水平的检测采用Real-time qPCR技术检测ampC及mexB的表达水平,以PAO1标准株中对应基因的表达情况作为对照。第三部分插入序列IS1411与铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的关系我们在第二部分实验中发现,大多数（13/15）碳青霉烯类耐药ST1158菌株均在oprD基因上存在插入序列IS1411。因此,我们将IS1411电转化导入PAO1标准株后,进行药敏试验以分析插入序列IS1411与铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药的关系。研究结果:（一）西南医院烧伤科铜绿假单胞菌分子流行病学及耐药情况调查研究:1、171株分离菌属于42个已知ST型别,25株分离菌属于16个新的ST型别。ST316,ST111,ST360、ST244、ST1158为最常见的5种ST型别。2、国际高风险克隆ST111在2014年6月-7月在我科出现暴发流行。3、43个菌血症同时伴有创面感染的患者中20个患者的血液和创面分离细菌ST型别不同。4、196株细菌中多耐药细菌（Multi-drug resistant,MDR）占54.59%,广泛耐药细菌（extensively drug resistant,XDR）占21.42%。126株（35.71%）对亚胺培南不敏感,133株（32.14%）对美罗培南不敏感。共有141株碳青霉烯类非敏感菌株（对亚胺培南或美罗培南不敏感）5、WN组细菌对各种的敏感性明显高于Bl组和WB组。（二）西南医院烧伤科铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药机制分析（本部分实验对象为第一部分实验中检测到的141株碳青霉烯非敏感菌株）1、所检测的11个碳青霉烯酶基因中,仅IMP和VIM两个基因有检出,IMP检出率为17.80%,VIM检出率为6.38%。2、oprD基因测序分析发现,125株（88.65%）铜绿假单胞菌的oprD基因出现了各种类型的突变,是本次临床分离菌株对碳青霉烯类耐药的主要机制之一。其中突变类型最多的是由于1个或几个碱基的插入或缺失（76%）,其余突变还包括碱基突变形成终止密码子,IS（Insertion sequence）插入,氨基酸点突变等。3、13/15株ST1158碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌中与oprD基因中存在插入序列IS1411,这是首次在铜绿假单胞菌中发现有该插入序列。4、ampC基因高表达率为68.09%,mexB基因高表达率为12.78%。（三）IS1411与碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌间的关系IS1411电转进入PAO1菌株后,宿主菌对亚胺培南产生耐药,对美罗培南的最低抑菌浓度增加。结论:1、西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌ST型别存在丰富的克隆多样性,提示烧伤病房铜绿感染来源广泛,需做好控制感染传播的各个环节。2、西南医院烧伤病房铜绿假单胞菌对一般抗菌药物及碳青霉烯类耐药情况均较严重,应继续重视抗菌药物的合理应用,并探究铜绿假单胞菌的耐药机制与抗感染策略。3、oprD基因突变伴随ampC的过表达是西南地区烧伤病房铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要原因;与欧洲某些国家碳青霉烯酶基因的高流行率不同,我中心IMP检出率较低,与中国其他地区报道基本一致。说明不同地域所分离的铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的主要耐药机制存在较大差异。4、首次在铜绿假单胞菌中发现IS1411,在标准菌株中证实了IS1411能通过插入oprD基因导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药,对美罗培南MIC值增加。