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表皮生长因子(Epidermal Growth Factot,EGF)是由53个氨基酸组成的多肽。因具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景, EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。螺旋藻是一类特殊的原核生物,它作为一种天然绿色食物,具有高安全性和高营养价值的特点,有着巨大的应用开发潜力。本实验的目的在于实现人表皮生长因子在螺旋藻中的表达,省去下游的分离纯化,以期开发出外敷产品应用于美容和皮肤烧伤、创伤的治疗、直接口服的美容保健品。
首先,构建用于转化的供体表达载体。根据螺旋藻密码子的偏嗜性,设计引物,用PCR技术扩增得到人表皮生长因子基因。利用NspI和NspI这两种同尾酶,经过多步链接、测序,构建成含有四个串联目的基因的重组载体。然后将此串联片段插入到含有蓝藻源的热休克groESL启动子、rbcS polyA终止区、同源重组片段recA基因和nptII基因的质粒中,构建成供体表达质粒pKREGF4。
其次,将构建好的供体表达质粒转化螺旋藻。我们将供体质粒用超声转化的方法转化钝顶螺旋藻,通过G418筛选,得到三株具有G418抗性且生长良好的转化藻株,分别命名为EGFA,EGFB,EGFC。以外源片段两侧引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增,证明目的片段已经整合到宿主的基因组DNA中。转化藻通过41℃热诱导后,进行SDS-PAGE,通过Western-blot,发现EGFB,EGFC藻株存在与预期外源目的基因表达产物大小相当的8.87kD左右的特异杂交带,证实特异蛋白的存在。而EGFA可能由于外源目的基因表达量过低或者基因未表达,没有检测到杂交信号。我们选取生长状态较好的转化藻EGFC进行大量培养,为后期验证转基因藻功能的动物实验做准备。
最后,我们通过乙酸诱导大鼠急性胃溃疡的实验,初步证明转基因螺旋藻在治疗大鼠急性胃溃疡方面有一定的功效,转基因藻的治疗效果好于野生藻,体现了转基因螺旋藻藻的优越性。
本研究通过超声转化的方法将目的基因人表皮生长因子hEGF片段整合到螺旋藻Spirulina platensis染色体上,并且从DNA和蛋白质水平检测了目的基因的表达情况,首次尝试了以螺旋藻作为转基因受体表达人表皮生长因子,为进一步研究开发具有人表皮生长因子功能的转基因螺旋藻产品奠定了基础。