随着“脑计划”的提出和快速推进,众多新技术手段被不断应用到脑科学研究领域,从而推动该领域出现前所未有的发展机遇和发展前景。作为大脑的能量供应系统,脑功能的正常发挥对供血以及正常血管功能有极高的要求,同时作为神经血管单元的重要组成部分之一,脑血管形态与功能的研究日益受到关注。双光子技术是神经影像学发展史上堪称革命性的技术,它的高时空分辨率成像,极大突破了传统影像学的局限,为脑科学的研究,包括脑血管系统的研究,打开了一个全新的视野。本研究以双光子激光扫描显微镜为主要技术手段,以研究脑微血管在不同疾病模型中的病理变化特点为目的,结合转基因小鼠、动物疾病模型、神经生化分析和血管网络矢量化分析技术,进行以下四部分工作:1、构建双光子显微镜活体脑血管成像研究体系目的:构建双光子显微镜活体成像研究体系,完成双光子图像分析和数据解析,为后续基于双光子技术的研究奠定坚实的基础。方法:采用小鼠开颅窗的手术方法,利用自行设计加工的头颅固定装置,实现活体小鼠的双光子显微镜观察;利用Tie2-GFP转基因小鼠,标记血管壁,同时注射DextranTexasRed标记血管腔,从而实现脑血管的形态学观察;利用双光子显微镜的线扫描模式以及Timelapse成像能力,实现脑血管血流动力学的活体测量;最后利用计算机数字图像处理技术实现双光子显微镜图像数据解析。结果:建立了双光子激光显微镜观察活体小鼠脑皮层血管网络以及血流的实验体系;能展开活体小鼠皮层深层次成像研究,大脑皮层在体成像深度可达520μm;确立了成像条件参数,实现大脑皮层脑血流方向以及血管类型的判定;建立了双光子成像数据分析计算方法,可以精确测量血管直径、血流速度及灌注量,并据此开发了图形用户界面的分析程序。该部分研究建立了脑微血管损伤可视化定量研究的基础。2、基于双光子技术研究在脑血管病危险因素下,糖尿病模型小鼠脑血管血流动力学变化规律及意义方法:小鼠一次性注射STZ溶液制作小鼠糖尿病模型,利用线栓法制作小鼠大脑中动脉缺血模型,利用激光多普勒测量脑局部灌注量,利用活体双光子显微镜成像技术,以高时空分辨率测量小鼠的脑血管形态以及血流动力学,同时结合蛋白质免疫印迹方法检测相关分子机制。结果:运用活体双光子激光扫描显微镜观测血流能获得更高的空间和和时间分辨率,其精确度与敏感度要远远高于激光多普勒血流仪;该病理过程中大脑皮层动脉、静脉及毛细血管脑血流、血管灌注量呈现不同变化规律;首次在活体实验动物观察到了糖尿病小鼠暴露于缺血损伤条件下大脑皮层微血管的湍流现象;证明了糖尿病中脑微血管血流异常有可能加重脑缺血后神经血管以及认知功能的损害。3、结合可视化技术开展基于脑脉络丛微血管病理改变的阿尔兹海默症发病分子机制研究方法:利用双光子活体成像技术,研究阿尔兹海默病小鼠模型中脑血管形态及血流动力学变化规律;利用双光子的厚样本高分辨率切片成像技术,对脉络丛结构进行了三维成像重建;结合免疫组化、免疫荧光、Western blot等经典研究方法,探究了阿尔兹海默病中脉络丛微血管病理改变分子机制。结果:利用双光子显微镜观测了 APP/PS1小鼠认知功能的损伤伴随着脑微血管血流速度、灌注量的严重下降;我们首次利用双光子显微镜以及组织透明化技术,对脉络丛进行了较大尺寸的三维成像重构,发现APP/PS1小鼠脉络丛呈空间结构紊乱及“肥大”状态;我们进一步发现淀粉样蛋白在脉络丛的沉积引起内皮细胞硝化应激,导致胞浆HtrA2蛋白量升高,进而引发细胞凋亡,破坏脉络丛功能。并在脉络丛内皮细胞上验证了调控硝化应激能逆转这一过程。由此,我们推测上述分子事件导致脉络丛形态异常以及功能障碍,为解析阿尔兹海默病发病机制提供了新的实验依据。4、基于双光子激光显微镜的血管网络矢量化分析方法:制备Gelatin-FITC荧光胶灌流血管,利用组织透明化技术对荧光胶灌流后的脑组织样本进行透明化处理,利用双光子激光扫面显微镜对透明后的组织进行较大尺度三维扫描,再利用计算机数字图像处理技术对血管体数据进行矢量化分析,结合流体力学、图论及网络学相关知识,分析血管网络的性质以及在阿尔兹海默症动物模型中的变化。结果:建立了 Gelatin-FITC荧光胶灌流血管方法,可稳定获取高信噪比的三维体数据,便于开展脑血管网络可视化研究;结合组织透明化和双光子显微镜成像,获取并重建了小鼠约0.5X0.5X0.5mm3大小的脑皮层血管网络;对血管网络进行矢量化分析,发现AD模型小鼠大脑皮层微血管异常增生,同时存在较高的血管阻力。综上所述,我们利用多参数时空动态成像初步揭示了脑微血管网络结构功能变化在神经系统疾病病程中的变化规律。探索了硝化应激等特异信号通路在脑微血管网络结构功能异常中的分子调控模式。本论文通过揭示脑微血管网络结构功能在神经精神疾病病程中的变化规律和发病机制,将为靶向神经血管单元的调控药物研发提供实验依据和新思路。