一、α珠蛋白基因拷贝数变异的检测方法研究拷贝数变异(Copy number variants, CNVs)是一种重要的结构变异,可通过改变基因的剂量或影响基因表达来改变表型或导致疾病。CNV在人类基因组中的分布非常普遍,可影响基因组中超过10%的序列。然而受限于检测手段,这类遗传变异直到最近几年才为研究者所重视并迅速成为当前人类遗传学研究的热点。以我们熟悉的α珠蛋白基因为例,可以看到该基因的拷贝数变异与α地中海贫血(简称α地贫)的临床表型间存在密切联系。正常个体中存在4个α珠蛋白基因。当1～4个α珠蛋白基因相继发生缺失时,可分别导致以下几种不同的临床表型：其中1个基因缺失时为“静止型”,没有可检测的临床症状,无明显血液学改变；2个基因缺失时为“标准型”,表现为典型的小细胞、低色素性贫血；3个基因缺失时为“中间型”,表现为血红蛋白病即HbH病,有明显的甚至严重的贫血症状,患儿从1岁左右即出现贫血,严重者肝脾肿大及黄疸,面黄肌瘦并伴骨骼变化,靠输血维持生命；4个基因都缺失时为“重型”,表现为致死性巴氏水肿胎综合症,是最严重的一种,生下来就是死胎或很快就死亡。除缺失外,α珠蛋白基因的重复会产生5个拷贝的α珠蛋白基因(αααanti3.7/αα或αααanti4.2/αα),这一额外的α珠蛋白基因会导致β地贫患者的临床症状加重。我们通过对α珠蛋白基因拷贝数的定量来确定基因型,直接筛查出地中海贫血的高危人群。不仅如此,还可以α珠蛋白基因为模型,探索出一种适用于其它靶基因位点拷贝数检测的通用方法,以满足目前对CNV-疾病间关系研究的需要。近年来,多种基于芯片的高通量方法用于识别全基因范围内的CNV,如芯片比较基因组杂交(Array comparative genomic hybridization, Array CGH)、SNP分型芯片(SNP genotyping arrays)以及深度测序方法(Deep sequencing-based approaches)。这些方法具有较高的分辨率,主要应用于全基因组范围CNV图谱的构建和疾病的关联分析,但并不适用于诊断针对某种疾病的特定基因位点的拷贝数变异。而针对靶基因位点CNV的检测方法有以下几种：多重可扩增探针杂交(Multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH),多重连接探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA),短荧光片段多重定量PCR (Quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments, QMPSF)以及实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)。作为筛查和诊断的目的,这几种方法都存在各自的优缺点。以目前应用较广泛的MLPA方法为例,该方法高效、特异,在一次反应中可以同时检测40多个靶序列拷贝数的改变。不足之处在于：1、开放式检测平台,容易造成污染;2、其设计的长探针不能通过普通的化学方法合成,需要通过M13载体克隆的方法获得；3、杂交步骤耗时过长(约16小时)。这些都限制了其作为分子筛查方法的推广和应用。实时荧光定量PCR是比较受欢迎的检测平台,因为操作简便,快速高效,具有很高的敏感性和特异性；其次,是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,有效的避免污染,而且直接检测结果,无需扩增后操作；另外,多荧光通道允许在同一反应体系中同时对多个靶序列进行扩增。该方法已广泛应用于针对特定位点进行拷贝数定量,对已知的CNV进行确认。但是多重PCR本身存在一些问题。如不同引物对之间的错配扩增,不同靶序列扩增效率不一致导致效率低的靶点被扩增效率较高的靶点所抑制,这些都会影响拷贝数定量分析。为了更好的利用实时定量PCR的优势,同时又避免多重PCR扩增效率不一致的缺点,我们建立了一种基于多重加尾引物扩增的巢式实时荧光定量PCR的新方法。我们选择α珠蛋白基因作为建立该方法的候选基因。该方法的建立,有助于在人群中大规模筛查α珠蛋白基因的重复和缺失,建立一种可靠的分子筛查方法。在此基础上,有望成为一种适用于其它疾病相关的CNV进行快速分型的通用方法。本方法的研究原理是针对特异位点序列设计加尾引物,包括上游引物和下游引物。经过有限循环的扩增后,扩增产物包含完整的基因组短片段序列及加尾序列。这样就将位点的起始拷贝数等比例转化为可供扩增的加尾产物的数目。然后加入通用引物及荧光检测探针,对不同位点的加尾产物同时扩增并记录荧光曲线Cq值。本研究将涉及到上述拷贝数变异的α1珠蛋白基因(简称α1)和α2珠蛋白基因(简称α2)作为待检基因,看家基因β-actin作为参考基因,将已知基因型的正常基因组样本作为标准品,对待检基因的拷贝数进行相对定量。将参考基因作为内标,标准品作为外标,对未知样品待测基因位点的Cq值进行双重标化,获得基因拷贝数数值。反应体系中总共包括三种引物及探针,分别为识别特异位点序列的加尾引物、通用引物与双标记的TaqMan探针。加尾引物由三个部分组成：特异位点的基因组序列、通用引物序列以及荧光标签序列,其中后两者的序列与人类基因组序列无关,是自行设计的寡核苷酸序列组合。每个加尾序列包含各自特异的22～23bp随机组合的荧光标签序列,用于结合不同荧光标记的检测探针,以通过不同荧光通道的扩增曲线将不同的待检基因区分开来。本研究拟建立的拷贝数定量方法是建立在不同位点均一扩增的基础上,所以在进行拷贝数计算之前,首先要评估不同位点的扩增效率是否一致。在效率一致的前提下,才能得出的可靠拷贝数定量结果。结果显示,在同一个反应体系中,α1、α2及β-actin的扩增效率分别为99.1%、98.2%及100.3%。用模板的稀释倍数的log值对每个稀释样品的目标基因与参考基因的Cq值之差ACq(Cq目标基因—Cq参考基因)作图,用最小方差线性回归法进行统计分析。结果显示两个待检基因α1和α2相对于参考基因β-actin的△Cq曲线斜率分别为0.019,0.029,接近于0,可认为待检基因与参考基因的效率一致。为评价本方法的检测灵敏度,我们将已知浓度(60.0ng)的正常基因型αα/αα样本进行2倍倍比稀释,用稀释后不同浓度(3.25ng-60.0ng)的模板进行扩增反应,获得Cq值后,计算不同浓度样本α1和α2的拷贝数比值。当浓度低至3.25ng/μL时,样本的α1和α2拷贝数比值与实际的基因型相符。其他5种基因型样本在此浓度下,得到的α1和α2拷贝数比值与基因型相符合。说明本方法的检测灵敏度至少可以达到3.25ng/μL。为检验方法的重复性,我们选取αα/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、-SEA/-α3.7---SEA/-α4.2、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、--SEA/-SEA、αααanti3.7/αααanti4.2这11种代表性基因型样本各2例,每例样本重复5次,对实验结果进行统计,考察本方法检测的重复性。实验结果得出的标准差SD为0.00～0.16,并且不同拷贝数(0-3copies)α/α2之间的拷贝数比值在95%可信区间范围内没有重叠,单因素方差分析统计结果具有显著差异。另外,3拷贝与2拷贝的待检基因样本在拷贝数上是1.5倍的差异,而在Cq值上仅相差0.585个循环,这种差异对于普通的多重荧光定量PCR方法来说,是比较难区分出的。本方法显示3拷贝基因型样本(包括αααanti37/αα及-α3.7/αααanti4.2)与正常2拷贝样本之间能有效的区分开。最后,我们还评价了本方法的特异性。我们选取了中国人16种不同的缺失型α-地中海贫血共95例基因组样本作为模板,进行反应。从结果上看,我们得到待检基因的实测拷贝数比值与样本已知的基因型相比较,符合率为100%,并且不同基因拷贝数之间的拷贝数比值没有重叠。本方法的创新之处在于：1、将待检基因的起始拷贝数转化为可供扩增的加尾产物的数量,通过一对通用引物对不同位点进行均一扩增,避免了直接扩增基因组序列所造成的效率不一致问题。2、将随机22-23bp的寡核苷酸序列作为“荧光标签”,与相应荧光标记的检测探针结合后,在具有5’外切酶功能的聚合酶作用下,释放荧光信号。每个待检基因加尾引物包含各自特异的“荧光标签”,通过不同的荧光通道扩增曲线的Cq值来区分待检基因。本研究中使用的“荧光标签”不仅用于检测α1和α2,同样适用于其它疾病相关的待检基因,使本方法具备了通用的特征。3、通过有限循环的PCR预扩增获得完整的基因组短片段序列,达到与MLPA方法中杂交过夜后再连接相似的效果,然而我们的方法大大缩短了反应时间,减少了反应步骤。本研究以α珠蛋白基因为模型,建立了一种针对疾病相关靶基因拷贝数变异进行相对定量的新方法。我们通过α1/α2的拷贝数定量,即可对中国人常见缺失型地贫进行筛查和诊断。本方法还可检测出三拷贝的α珠蛋白基因,这样我们一方面可应用该方法进行大规模人群筛查以获得完整的中国人群中三联体的分布频率数据,另一方面,三联体的检出有助于对中间型p地贫患者提供更准确的基因诊断和遗传咨询。在此基础上,我们还可将本方法推广到其它致病基因拷贝数变异的快速分型和诊断的应用中。二、快速诊断常见中国人缺失型α-地中海贫血的方法学研究α-地贫是世界上最常见的单基因遗传病,也是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病。本病是由于第16号染色体短臂末端α-珠蛋白基因缺陷所致,分为缺失型和非缺失型两种,其中缺失型是主要类型。在广东人群中,超过96%的α-地中海贫血是由东南亚缺失(--SEA)、左侧缺失(-α4.2)和右侧缺失(-α3.7)引起。本病尚无有效治疗方法,携带者筛查及产前基因诊断是唯一防止新的患儿出生、提高人口素质的有效措施。目前,多种分子诊断技术已用于α-地中海贫血的诊断检测。其中多重Gap-PCR已广泛用于α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断,但该方法使用凝胶电泳进行结果分析,一方面容易造成污染,另一方面检测通量也受到限制。目前,实时定量PCR已广泛应用于临床实验室,该平台是在封闭系统中进行反应,且无需扩增后操作,直接检测结果,能有效避免污染,且通量较高。因此,本研究拟建立一种基于实时荧光定量平台的,具有稳定性好、重复性高的诊断方法,以快速诊断出中国人中常见的三种缺失型α-地中海贫血。本方法是一种基于多重探针连接反应的巢式实时荧光定量PCR技术,通过连接酶反应获得完整的待检基因序列,同时通用引物序列和荧光标签也被加入到产物中,以实现不同待检基因一致扩增的效果。使我们在一个反应管中,可以同时检测出三种常见的缺失类型。本研究的设计原理是针对待检基因序列设计若干对寡核苷酸连接探针,每对连接探针分为左侧探针和右侧探针,分别位于待检基因序列的相邻部位。当探针与基因组DNA模板结合后,通过连接酶的连接反应,将左侧和右侧探针连接,形成一条可供扩增的完整的连接产物。这样就将待检基因的起始拷贝数转化为可供扩增的连接产物的数目。所有待检基因的左侧探针和右侧探针上都含有相同的通用引物结合位点,这样我们可以通过一对引物即可同时扩增不同的连接探针。且不同待检基因的左侧探针上有一段独特的“荧光标签”,用于结合荧光检测探针,经实时荧光定量PCR反应后,不同荧光基团标记的检测探针可以指示不同的可供扩增的连接产物数量,即间接指示了对应基因的拷贝数。并且利用外切酶I切割单链的效应,将连接反应中过量的连接探针水解掉,降低荧光定量的背景干扰。我们获得代表不同待检基因的荧光曲线Cq值,用参考基因及标准品进行标化后,即可获知待检基因的拷贝数情况,判断是否有缺失。我们考察了多个反应因素对连接反应体系和实时荧光PCR检测体系的影响,确定了各因素的最佳反应条件。在重复性试验中,我们以3例缺失型样本及1例正常对照样本为模板,每个样本重复5次实验,采集拷贝数定量数据,进行统计分析。结果发现SD值为0.04-0.12,CV为3.64～16.46%,拷贝数范围区间没有重叠,具有良好的可重复性和区分能力。与MLPA方法相比,本方法最显着的优点之一就是连接探针完全采用化学合成的方法获得。MLPA技术中的右侧杂交探针有一段"barcode序列”,不同探针的“barcode序列”长度不同,扩增后通过毛细管电泳来检测PCR产物的长度,从而得出相关探针对应位点的拷贝数。这使得右侧杂交探针长度由80bp-400bp不等,如此长的探针无法通过普通的化学方法进行合成,只能采用M13噬菌体克隆获得。由于杂交探针数目众多,这就决定了这项工作的繁琐性,不利于这项技术的应用和推广。本方法将原先的"barcode序列”变为“荧光标签”,由依靠杂交探针长度区分变为依靠检测探针区分。这样所有的单个连接探针长度都不超过70bp,完全可以采用化学合成的方法获得,大大节省了人力和物力,保证了探针合成的数量和质量,并且有利于这项技术的推广应用。在MLPA中,仅杂交过程就需要16小时,主要是因为其使用的探针长度过长,且为了减少未反应的探针浓度,使用较低浓度的杂交探针(10pmol),这两种因素导致杂交反应时间过长。在本研究中,我们设计连接探针均为短片段,其采用相对高浓度(10nmol),大大超过模板DNA的浓度,30分钟即可完成快速高效连接。大大缩短了操作时间,这对临床诊断无疑具有重要的意义。本研究依靠连接探针上检测序列的不同区分不同目的基因而非像传统MLPA技术那样依靠杂交探针长度不同区分,因此所有连接探针的长度保持一致,采用了化学合成的方法即可获得而不需要通过M13噬菌体克隆获得,这个过程大大降低了劳动强度、时间成本、试剂和人力成本。本研究率先采用基于连接酶反应的实时荧光定量PCR来定量α1/α2的拷贝数,从而对中国人常见的三种缺失型地中海贫血进行分型。通过临床广泛使用的实时荧光定量PCR仪,为缺失型α地中海贫血进行大规模人群筛查及快速诊断提供了新的方法学模型。